李乾崗,魏 婷,張光明,仙 光

中國人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100872

白洋淀位于雄安新區(qū)核心地帶，是華北地區(qū)最大的淡水濕地，對區(qū)域生態(tài)調(diào)節(jié)與社會發(fā)展具有重要意義[1-2].然而，由于周邊農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致白洋淀水質(zhì)長期處于富營養(yǎng)化狀態(tài)[3]，大量氮、磷沉積在底泥中[4]，增加了白洋淀地區(qū)氮、磷內(nèi)源污染的風(fēng)險[5-6].近年來隨著白洋淀流域治理穩(wěn)步推進(jìn)，尤其是在雄安新區(qū)設(shè)立之后，水質(zhì)持續(xù)改善[2].2019年8月采樣結(jié)果表明，白洋淀大部分地區(qū)的水質(zhì)達(dá)到GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》Ⅳ類標(biāo)準(zhǔn).在外源污染得到有效控制、上游來水水質(zhì)較好且相對穩(wěn)定時，內(nèi)源污染將成為水中氮、磷污染的主要來源[7].上覆水理化性質(zhì)、底泥性質(zhì)以及對底泥擾動時間與強度都會影響底泥氮、磷釋放[8].在白洋淀這種底泥與水質(zhì)條件相對穩(wěn)定的自然水域中，底棲動物所產(chǎn)生的生物擾動作用成為促進(jìn)底泥污染物釋放的主要動力[9].生物擾動作用是指底棲動物通過呼吸、捕食等生命活動，攪動周邊的底泥環(huán)境，促進(jìn)底泥中物質(zhì)再分配的過程[10].生物擾動會增加底泥與水體之間的物質(zhì)通量[11]，促進(jìn)底泥中氮、磷等污染物質(zhì)釋放到水中[12]，同時還會改變濕地中微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對濕地水質(zhì)凈化功能產(chǎn)生影響[13].因此，探究底棲動物的生物擾動作用對白洋淀底泥氮、磷釋放及微生物的影響，對白洋淀水質(zhì)保護(hù)具有十分重要的意義.

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)屬軟體動物門、瓣鰓綱、蚌目、蚌科，是白洋淀地區(qū)代表性底棲動物[14].它是一種濾食性貝類，可有效控制水體富營養(yǎng)化、抑制有害藻類繁殖，促進(jìn)沉水植被系統(tǒng)構(gòu)建，因而被廣泛應(yīng)用于濕地水體修復(fù)中[15-17].廖日紅等[18]采用三角帆蚌控制水體富營養(yǎng)化，發(fā)現(xiàn)上層吊養(yǎng)三角帆蚌更有利于降低水體葉綠素a含量、提高水體透明度.張毅敏等[19]研究了鲴和三角帆蚌協(xié)同對富營養(yǎng)化水體的凈化，發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞去除率可達(dá)86.11%，對水中NH3-N和TP的去除率均在60%以上.但是已有研究都忽視了三角帆蚌擾動對底泥氮、磷釋放及其對微生物的影響.因此，該研究以三角帆蚌為試驗對象，以白洋淀淀區(qū)水和自然泥為試驗材料，通過室內(nèi)模擬試驗探究三角帆蚌的生物擾動作用對底泥中氮、磷釋放的影響，并結(jié)合16S rRNA高通量測序技術(shù)，討論其對水和底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，以期為白洋淀濕地修復(fù)和內(nèi)源污染控制技術(shù)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料與裝置

試驗用三角帆蚌來自當(dāng)?shù)啬仇B(yǎng)殖場，選取大小基本相同、活力較為旺盛的蚌體進(jìn)行試驗，蚌體質(zhì)量為(202.7±13.6)g.試驗前將表面清刷干凈，在暴曬處理2 d的自來水中馴養(yǎng)1周.

試驗用水、泥來自白洋淀西區(qū)入淀區(qū)，整體水質(zhì)為GB 3838—2002 Ⅳ類標(biāo)準(zhǔn).

采用圓柱形有機(jī)玻璃柱(底內(nèi)半徑10 cm、高40 cm)為試驗裝置，底泥厚度5 cm，液面高度30 cm.在距液面10 cm處進(jìn)行等功率曝氣，保持上覆水中DO濃度為4～6 mg/L，并模擬自然復(fù)氧和自然風(fēng)力攪動過程.

1.2 試驗方法

向上述試驗裝置中加入三角帆蚌一只，運行15 d，每天固定時間在距液面10、20和30 cm處分別等量取樣、混勻檢測水質(zhì)指標(biāo)，隨后補充試驗用水至原高度.進(jìn)行平行試驗，并設(shè)置無三角帆蚌的對照組.檢測上覆水中TN、NH3-N、可溶性NH3-N、TP、可溶性磷的濃度.此外，對試驗前后底泥中全氮、全磷含量和試驗結(jié)束后水體及底泥中微生物群落進(jìn)行檢測.

1.3 檢測和分析方法

1.3.1水質(zhì)及底泥氮、磷檢測

TN濃度采用HJ 636—2012《水質(zhì) 總氮的測定 堿性過硫酸鉀紫外分光光度法》測定；NH3-N濃度采用HJ 535—2009《水質(zhì) 氨氮的測定 納氏試劑分光光度法》測定；TP濃度采用GB 11893—89《水質(zhì) 總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》測定；CODCr濃度采用HJ/T 399—2007《水質(zhì) 化學(xué)需氧量的測定 快速消解分光光度法》測定；底泥中全氮含量采用HJ 717—2014《土壤質(zhì)量全氮的測定 凱氏法》測定；底泥中全磷含量采用HJ 632—2011《堿熔—鉬銻抗分光光度法》測定.

1.3.2微生物群落結(jié)構(gòu)分析

底泥微生物樣品預(yù)處理：利用注射器采集表層底泥50 mL，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液后-20 ℃保存.

上覆水微生物樣品預(yù)處理：利用注射器采集距液面10、20、30 cm處的水樣共150 mL，過0.22 μm濾膜后，-20 ℃保存.

對預(yù)處理樣品進(jìn)行微生物群落高通量測序分析.基于二代高通量測序，測定16S rRNA V4區(qū)PCR產(chǎn)物，對各樣品中微生群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(引物為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,806R：5′-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3′).DNA的提取、PCR、建庫和測序均由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成，測序使用平臺為Illumina Miseq platform(Illumina，USA).

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，以P值判斷數(shù)據(jù)顯著性，當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異性.微生物組間差異采用費舍爾精確檢驗(Fisher exact test).

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)常用來估算樣本中微生物多樣性，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)越大，表明微生物群落多樣性水平越高，其計算公式：

(1)

式中，Sobs為實際觀測到的OTU數(shù)目，ni為第i個OTU所含的序列數(shù)，N為所有序列數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 上覆水中TN與NH3-N濃度的變化

上覆水中TN濃度的變化規(guī)律如圖1所示.由圖1可見，0～7 d，對照組中TN濃度高于試驗組，第8天發(fā)生改變，這可能是由于試驗前期三角帆蚌活力較低.試驗結(jié)束時，試驗組TN濃度為對照組的1.18倍，達(dá)4.1 mg/L，這與張毅敏等[19-21]研究結(jié)果類似，表明三角帆蚌的生物擾動作用會提高底泥氮的釋放速率，增加上覆水中TN濃度.底棲生物的生物擾動作用會改變底泥的物理形態(tài)，促進(jìn)底泥顆粒物質(zhì)的再懸浮，從而提高底泥中污染物的釋放通量[9].CHENG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Chironomidlarvae和Limnodrilushoffmeisteri的生物擾動增加了底泥的孔隙度，提高了底泥間歇水和上覆水中Cr含量，促進(jìn)了底泥Cr的釋放速率.Nizzoli等[23]研究也表明，貝類的生物擾動作用促進(jìn)了底泥中氮的釋放，增加了上覆水中TN濃度.另外，底棲生物活動還會提高濕地的脫氮效率.KANG等[24-25]利用蚯蚓強化人工濕地，提高了濕地的反硝化效率，使得氮去除率增加22.27%，貝類活動也可將人工濕地氮處理效率提高15.72%.由此可見，底棲生物對水體TN的影響具有兩面性，不同生物的影響效果也不盡相同.在該研究中，三角帆蚌會提高上覆水中TN濃度，不利于白洋淀水體TN的去除.

圖1 試驗期內(nèi)各處理組上覆水中TN濃度的變化Fig.1 Change of TN in overlying water of both groups during the experiment

上覆水中NH3-N濃度及可溶性NH3-N與顆粒態(tài)NH3-N占比的變化如圖2所示.由圖2(a)可見，對照組中NH3-N濃度在0～3 d上升，3～7 d下降，隨后維持在0.37 mg/L左右.試驗組中NH3-N濃度則在0～3 d上升，隨后維持在0.76 mg/L左右，約為對照組的2.1倍，可見三角帆蚌的生物擾動作用促進(jìn)了底泥中的NH3-N向上覆水?dāng)U散.由圖2(b)可見，第3天時，對照組與試驗組中顆粒態(tài)NH3-N和可溶性NH3-N的占比基本一致，而第15天時試驗組中顆粒態(tài)NH3-N的占比明顯高于對照組.同時，二者可溶性NH3-N濃度在試驗后期差異不大(P>0.05)，表明三角帆蚌的生物擾動作用主要促進(jìn)了底泥中顆粒態(tài)NH3-N的釋放，從而提高了顆粒態(tài)NH3-N的占比.鄧可[26]研究發(fā)現(xiàn)，底泥在貝類擾動影響下，可溶性NH3-N釋放量會隨時間延長而逐漸降低，與對照組沒有顯著差異，與該研究結(jié)果類似.結(jié)合圖2(a)可知，在三角帆蚌生物擾動作用的影響下，顆粒態(tài)NH3-N濃度增加是上覆水中NH3-N濃度增加的主要來源.NH3-N是白洋淀地區(qū)底泥釋放潛力較大的一種污染物[27]，但生物擾動造成的顆粒態(tài)NH3-N濃度增加可能不會對水質(zhì)產(chǎn)生較大影響.研究[26,28]表明，植物可以通過吸附等作用，降低上覆水中顆粒態(tài)物質(zhì)濃度，從而在很大程度上降低甚至消除三角帆蚌造成的這一負(fù)面影響.

圖2 試驗期內(nèi)各處理組上覆水中NH3-N濃度及存在形式的變化Fig.2 Change of NH3-N concentration and its form in overlying water of both groups during the experiment

2.2 上覆水中磷濃度的變化

圖3為試驗期內(nèi)上覆水中TP和可溶性磷濃度的變化情況.各處理組均達(dá)到了底泥與上覆水之間磷的釋放吸附平衡，試驗組TP平衡濃度約為對照組的2.2倍，表明三角帆蚌的生物擾動作用能極大地促進(jìn)底泥磷的釋放.TP與可溶性磷的濃度變化規(guī)律一致，表明上覆水中可溶性磷濃度增加是TP濃度增加的主要來源.在Nizzoli等[23]和ZHANG等[29]研究中，均發(fā)現(xiàn)貝類底棲生物能夠極大地促進(jìn)底泥中磷的釋放，與該研究結(jié)果一致.白洋淀濕地中，三角帆蚌能夠促進(jìn)可溶性磷釋放，客觀上會提高水體中生物可利用磷的含量，增加植物對營養(yǎng)鹽的吸收，促進(jìn)植物生長[30].KANG等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，貝類和蚯蚓的生物擾動提高了濕地水體中可生物利用磷的濃度，促使香蒲葉綠素含量提高了23.5%，植株高度增加了29.1%.但需要注意的是，由三角帆蚌引起的可溶性磷濃度增加會對水質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響.研究[31-33]表明，底泥吸附是濕地去除磷的最主要方式，占濕地除磷總量的36%～50%，植物和微生物等生物作用對水體除磷的效果相對較小.因此，在利用三角帆蚌等底棲動物進(jìn)行濕地修復(fù)時，應(yīng)當(dāng)充分考慮生物擾動所帶來的負(fù)面影響，將其生物量控制在合理范圍內(nèi).

圖3 試驗期內(nèi)各處理組上覆水中TP與可溶性磷濃度的變化Fig.3 Change of TP and soluble P in overlying water of both groups during the experiment

2.3 底泥中全氮、全磷含量的變化

圖4為試驗前后底泥中全氮、全磷含量的變化情況.試驗組底泥中全氮、全磷含量均低于對照組，表明三角帆蚌的生物擾動會降低底泥中全氮、全磷的含量，這與李俊偉等[21]的研究結(jié)果一致.試驗組底泥中全氮、全磷的削減率分別比對照組提高了26.0%和10.9%，表明三角帆蚌對底泥全氮的削減更加明顯.生物擾動會促進(jìn)底泥中污染物向水中的釋放，從而降低污染物在底泥中的過量積累[28]，但擾動作用對底泥中氮、磷釋放的影響存在差異[34].張強等[35]研究發(fā)現(xiàn)，擾動作用對底泥中氮的釋放促進(jìn)作用更強，對磷釋放的影響則相對較弱，與該研究結(jié)果一致.也有研究[25,32]表明，底棲生物的活動可以降低底泥中DO濃度，其糞便也可以為反硝化提供優(yōu)質(zhì)碳源，從而提高底泥脫氮效率.該研究中三角帆蚌的生物擾動作用促使上覆水中CODCr濃度從27.59 mg/L升至32.87 mg/L，有助于反硝化的進(jìn)行.因此，三角帆蚌活動可提高微生物的脫氮效率，是底泥中全氮削減效率高于全磷的另一原因.

圖4 試驗前后各處理組底泥中全氮、全磷含量的變化Fig.4 Change of total nitrogen and total phosphorus in sediments of each treatment group before and after the test

三角帆蚌減少了沉積物中氮、磷污染物含量，表現(xiàn)出了較好的沉積物生物修復(fù)潛力.沉積物生物修復(fù)不同于傳統(tǒng)的修復(fù)技術(shù)，能最大限度地保護(hù)濕地原生基底，不會造成大的生態(tài)風(fēng)險[36-37].該研究中三角帆蚌提高了底泥中全氮、全磷削減率，為白洋淀底泥污染的生物修復(fù)提供了新的思路.此外，結(jié)合圖1～3可知，三角帆蚌的生物擾動作用促使底泥中相當(dāng)一部分氮、磷釋放到了上覆水中，但還有一部分氮、磷可以通過三角帆蚌自身的吸附作用以及微生物活動從系統(tǒng)中去除[19,38]，具體的污染物去向有待進(jìn)一步的試驗探索.

2.4 水體與底泥中微生物群落的變化

表1列舉了不同處理組水體與底泥中微生物在門水平上的相對豐度.結(jié)合圖5(a)可知，三角帆蚌將水中藍(lán)細(xì)菌的豐度降低了34.86%，表明三角帆蚌對藍(lán)細(xì)菌有強大的濾食作用.在三角帆蚌的影響下，水中變形菌門的豐度劇增，高出對照組47.98%，但三角帆蚌對底泥中微生物豐度影響較小.

注：CK-S、CK-W、EG-S、EG-W分別表示對照組底泥、對照組水體、試驗組底泥、試驗組水體.圖5 各處理組水體與底泥中微生物群落的變化Fig.5 Change of microbial communities in water and sediment of each treatment group

結(jié)合圖5(a)和表1可知，水體中存在變形菌門、放線菌門、綠彎菌門等多種微生物，其中以變形菌門為優(yōu)勢菌，這與試驗用水為自然湖水有關(guān)[39-41].變形菌門是自然水體中存在最為廣泛的微生物類群，主要由α綱、β綱和γ綱組成，包含了水體脫氮除磷的多種功能菌群[42]，能夠去除水中多種污染物質(zhì).微生物對環(huán)境變化十分敏感，水體中藍(lán)細(xì)菌豐度下降，氮、磷含量上升，為變形菌門微生物提供了足夠的生長空間和豐富的養(yǎng)分，促使其含量劇增.放線菌門微生物可以分泌多種酶或抗生素，有利于植物病蟲害的生物防治[43].綠彎菌門微生物是活性污泥中微生物成分之一，可以進(jìn)行光合作用但不產(chǎn)生氧氣，與擬桿菌門微生物一起降解有機(jī)物[44].擬桿菌門微生物能促進(jìn)水體中多種有機(jī)物的降解，是污水處理中主要的有機(jī)物降解微生物類群，尤其對蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化效果較好[45].酸桿菌門微生物是一類嗜酸菌，主要存在于土壤中，在該研究中水體呈弱堿性，因此酸桿菌門微生物數(shù)量很少[46].厚壁菌門微生物在反硝化過程中起到重要作用，并且厚壁菌門中的芽胞桿菌屬(Bacillus)微生物是一類溶磷能力較強的磷細(xì)菌，可以促進(jìn)濕地中磷向可溶性磷轉(zhuǎn)化[47-48].硝化螺旋菌門中的硝化螺旋菌屬(Nitrospira)是一類重要的硝化細(xì)菌，參與氮循環(huán)過程，可將NO2--N氧化成NO3--N[49].

表1 各處理組水體與底泥中微生物群落門水平上的相對豐度統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Statistical results of microbial relative abundance in water and sediments of different groups at phylum level

該研究中，各處理組上覆水中變形菌門的主要類群均為γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)和α-變形菌綱(α-Proteobacteria).這兩個綱包含了多種硝化功能菌，能夠促進(jìn)水體硝化進(jìn)程[44,50].在三角帆蚌的影響下，水體中的變形菌門豐度大幅增加，硝化功能菌群數(shù)量也相應(yīng)地增加，加之水體始終處于富氧狀態(tài)，促進(jìn)了NH4+-N向NO2--N和NO3--N的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致試驗組水中可溶性NH3-N濃度偏低.同時，試驗組中硝化螺旋菌門微生物的小幅增加也促進(jìn)了硝化過程.而富氧環(huán)境則會抑制水中反硝化菌活性，導(dǎo)致試驗組水體中TN濃度偏高.另外，γ-變形菌綱假單胞菌屬(Pseudomonas)微生物和厚壁菌門芽胞桿菌屬微生物是溶磷能力較強的兩類磷細(xì)菌[49].在三角帆蚌影響下，水中變形菌門豐度(47.98%)劇增，厚壁菌門豐度(3.70%)小幅增加，進(jìn)而增加了溶磷細(xì)菌數(shù)量，促進(jìn)了水中有機(jī)磷向可溶性磷的轉(zhuǎn)化.擬桿菌門和綠彎菌門是促進(jìn)濕地中有機(jī)污染物分解的重要微生物類群[44]，擬桿菌門和綠彎菌門微生物總體豐度降低，可能是水體中CODCr濃度升高的原因之一.

如圖5(b)所示，三角帆蚌提高了水體微生物多樣性，對照組與試驗組的Shannon-Wiener指數(shù)分別為3.9和4.2，但其對底泥中的微生物多樣性影響甚微(P>0.05).Papaspyrou等[51]研究發(fā)現(xiàn)，底棲生物Nereisdiversicolor和Nereisvirens的活動使得洞穴中細(xì)菌多樣性較周邊底泥分別高出1.8和2.3倍.這表明不同底棲生物對微生物多樣性的影響具有差異性.該研究中，三角帆蚌通過其強大的濾食作用，極大地減少了水體中藍(lán)細(xì)菌數(shù)量，增加了其他微生物的生態(tài)位，從而顯著提高了水體中微生物的多樣性和功能菌群的豐度.藍(lán)細(xì)菌是造成水體富營養(yǎng)化的主要微生物[52]，三角帆蚌能高效去除藍(lán)細(xì)菌，有效控制藻類過度繁殖，提高水中脫氮除磷功能菌群豐度，表明其適合修復(fù)富營養(yǎng)化風(fēng)險較大的水體.

3 結(jié)論

a) 三角帆蚌的生物擾動作用明顯，上覆水中TN、NH3-N和TP的濃度分別提高了0.18、1.1和1.2倍，其擾動主要通過增加顆粒態(tài)NH3-N和可溶性磷的濃度來增加上覆水中NH3-N和TP的濃度.

b) 三角帆蚌的活動顯著降低底泥中全氮、全磷的含量，且對全氮的削減率(26.0%)高于全磷(10.9%).底泥中氮、磷釋放規(guī)律的不同是導(dǎo)致全氮削減率高于全磷的主要原因.

c) 三角帆蚌的濾食作用極大地降低了水中藍(lán)細(xì)菌的豐度，促進(jìn)了水中變形菌門豐度的增加.三角帆蚌提高了水體中脫氮除磷功能菌豐度和微生物多樣性，降低了水體中有機(jī)物降解微生物的豐度，但其對底泥中微生物的豐度和多樣性影響很小.