張慧敏，周如國，2，于澤權，馬曉靜，2，姚日生

（1 合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥230009；2 悅康藥業(yè)集團安徽生物制藥有限責任公司，安徽阜陽236033）

近年來，生物表面活性劑[1]由于具有表面/界面活性好、選擇性高、環(huán)境友好[2]、良好的抑菌作用等特點被人們關注，根據(jù)親水部分的結構不同，主要可分為糖脂類、脂肪酸類、脂肽類和聚合表面活性劑。其中，糖脂類生物表面活性劑由于其高產量得到廣泛研究，具有乳化、分散、增溶、發(fā)泡、滲透、潤濕等功能[3]?；碧侵琜4]是一類目前產量最高的糖脂類生物表面活性劑，主要是由球擬假絲酵母（Starmerella bombicola）等經(jīng)過發(fā)酵獲得的次級代謝產物，除具有優(yōu)良的表面/界面活性、乳化/分散活性外，還具有無毒或低毒，生物可降解，不致敏、可消化，生物可再生[5]，環(huán)境兼容性好，結構多樣，抗菌、抗病毒、抗腫瘤[6]等藥理作用和免疫功能等優(yōu)點。因此，槐糖脂在醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護、日化工業(yè)、石油工業(yè)、農業(yè)及納米科技等領域有著巨大的開發(fā)潛力和應用前景。王曉峰等[7]選用陰離子型表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉與內酯型槐糖脂復配，并使用硅酸鈉作為助劑修復石油污染土壤，三者間的復配使得洗脫率達到了87.37%；陳靜等[8]發(fā)現(xiàn)當質量濃度達到1mg/mL時，槐糖脂對大腸桿菌的抑制率可達87%，對枯草芽孢桿菌的抑制率可達91%。除科學研究，關于槐糖脂的應用研究也已經(jīng)趨于成熟，初步進入了工業(yè)化生產和應用推廣階段。國外Saraya、Soliance、Allied Carbon Solutions Ltd.、 DSM Nutritional Products、 Ecover Belgium等大型公司已將槐糖脂應用于食品、藥品、殺菌劑、洗滌劑、化妝品和采油等領域[9]。

微生物天然合成的槐糖脂是由一系列結構類似物組成的混合物，主要分為酸型和內酯型兩大類，可選擇性地用于不同領域。一般來說，內酯型槐糖脂具有較高的親脂性，可降低液體表面張力，其抑菌、抗癌等活性較高；酸型槐糖脂具有更好的水溶性和發(fā)泡能力，是優(yōu)良的發(fā)泡劑[10]。而天然獲得的槐糖脂通常為混合物，往往存在以下缺陷：以不同底物發(fā)酵合成的內酯型與酸型槐糖脂的產量和比例會出現(xiàn)不同[11]，導致不同廠家或同一廠家不同批次的產物均一性無法保證，從而在應用中難以確定槐糖脂用量，或產生使用效果出現(xiàn)偏差的問題。內酯型槐糖脂與酸型槐糖脂因結構不同而導致理化特性及生物活性不同，因此可發(fā)揮不同的作用，若以混合物的形式發(fā)揮其中某一類成分的作用，則浪費另一類成分的槐糖脂。在科學研究中，若以混合物形式探索槐糖脂的性質，則難以確定真正發(fā)揮效用的部分，結合槐糖脂混合物中兩類槐糖脂的產量和比例常常不同的問題，可能會出現(xiàn)實驗結果難以重現(xiàn)，無法進行進一步的研究。因此，若要充分發(fā)揮槐糖脂的特性，更好地將其應用于各個領域，提高每類組分的利用率，必須將二者分離。實驗室水平主要通過有機試劑萃取法和離心法[4,9]對兩類槐糖脂進行分離純化。

目前，槐糖脂的應用研究[12]在不斷發(fā)展，槐糖脂的工業(yè)化生產和應用前景十分廣闊。但是與實驗室水平不同的是，在工業(yè)化生產中，微生物的生長、發(fā)酵過程以及產物的分離純化方法由于尺度效應會有所改變，所以傳統(tǒng)的有機溶劑法和離心法已不適用于工業(yè)化生產。此外，考慮到環(huán)保、健康和安全分析，有機溶劑萃取法需使用大量有機試劑，高速離心會產生大量能耗和巨額前期投入，因此傳統(tǒng)的工藝也需要升級和改進。

基于以上原因，本文考察和論證了利用已經(jīng)成熟且工業(yè)化應用的樹脂分離技術[13]、膜分離技術[14]及超濾-濃縮技術[15]用于槐糖脂分離、純化及濃縮的可行性。利用自然沉降法替代傳統(tǒng)乙酸乙酯萃取法獲得內酯型槐糖脂，利用板框過濾替代傳統(tǒng)實驗室離心法去除菌絲體，利用樹脂吸附及超濾法除雜替代實驗室及生產中常用的有機溶劑萃取法及醇沉法，通過板框過濾-樹脂吸附-超濾納濾濃縮法獲得高純度的酸型槐糖脂產品。該預處理及分離純化工藝可以獲得高純度的內酯型槐糖脂與酸型槐糖脂，填補了市售產品均為兩者混合物的缺陷，還可以減少有機試劑的使用量，提高槐糖脂生產的安全性與可行性。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

槐糖脂發(fā)酵液，某公司市售槐糖脂（總含量50g/L），pH 計，EC-214 電導率儀，數(shù)顯恒溫水浴鍋，UV-752 型紫外可見分光光度計，不同樹脂柱（100cm×12cm，填料1L），R-201 旋轉蒸發(fā)儀，冷凍離心機（Eppendorf，德國），膜分離中試裝置[HF-C-S-9X1-01型，凱能高科技工程（上海）有限公司生產]，Agilent 1100 series HPLC 分析系統(tǒng)（Shimadzu，日本）等。

1.2 處理及檢測方法

1.2.1 發(fā)酵液的預處理

發(fā)酵結束后，升溫至50℃滅菌處理40min，自然降溫1.5h，同時關閉攪拌和降低空氣流量，將發(fā)酵液收集到細長形圓柱狀的容器中，下接高30cm、直徑2.5cm 的細長玻璃柱，靜置20min 后收集下層黏稠狀內酯型槐糖脂。取上層發(fā)酵液，向其中加入硅藻土[16-17]，進行板框過濾、循環(huán)過濾直到濁度穩(wěn)定，隨后進行樹脂處理。

（1）助濾劑硅藻土添加量的選擇 向上層發(fā)酵液中分別添加不同量的硅藻土，使其添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，進行板框過濾，以發(fā)酵液濁度、槐糖脂回收率及發(fā)酵液蛋白含量為評價指標確定助濾劑硅藻土的添加量。

（2）板框過濾濾布層數(shù)的選擇 確定硅藻土添加量后，考察1～6層濾布對過濾效果的影響。將工廠現(xiàn)有的滌綸材質濾布裁剪成尺寸為0.3m×0.3m的方形，按照要求提前安裝在板框上，將發(fā)酵液分成6 個批次，每次過濾后清洗設備，更換新的濾布。以槐糖脂回收率、發(fā)酵液濁度、蛋白含量為評價指標確定濾布層數(shù)。

1.2.2 樹脂的預處理

（1）離子交換樹脂預處理[18]首先使用無水乙醇攪拌浸泡離子交換樹脂4h；隨后用去離子水反復漂洗至無乙醇殘留，以去除樹脂里的有機溶劑和雜質殘留；再用8 倍體積的1mol/L HCl 攪拌浸泡8h，用去離子水反復沖洗至中性；隨后再用1mol/L NaOH攪拌浸泡8h，用去離子水反復沖洗至中性；最后用8 倍體積的1mol/L HCl 攪拌浸泡8h，用去離子水洗至中性備用。經(jīng)過上述酸-堿-酸的浸泡方式處理后，陰離子交換樹脂轉型為氯型，陽離子交換樹脂處理成氫型。

（2）大孔吸附樹脂預處理[19]將新購的DM700型大孔樹脂用乙醇浸泡24h，使之充分膨脹，去除上面漂浮的碎片和雜物后濕法上柱，用乙醇沖洗至流出液與水混合不產生渾濁后，用2%的NaOH 溶液浸泡洗脫，用蒸餾水洗脫至中性，再用乙醇浸泡洗脫，最后用水沖洗至無醇味，備用。

1.2.3 脫色、脫鹽、脫蛋白處理

將經(jīng)過板框處理的發(fā)酵液依次通過陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、吸附樹脂進行脫色、脫鹽、脫蛋白處理[20]。樹脂吸附流速為1～2BV/h。

1.2.4 超濾-納濾濃縮處理

在超濾處理過程中，首先考察0～30min內超濾膜通量的變化情況。

將通過樹脂柱的發(fā)酵液先通過卷式超濾膜，進一步去除殘留在發(fā)酵液中的無機鹽、小分子以及殘留底物等，使得發(fā)酵液具有進行納濾濃縮的條件。超濾壓力為5MPa、超濾膜截流分子量為1萬～2萬、面積為2m2，超濾至發(fā)酵液全部通過。收集超濾之后的發(fā)酵液，納濾濃縮5～10倍[21-22]，對納濾處理后的發(fā)酵液進行旋轉蒸發(fā)以去除納濾液中的部分水分，得到含水量較低的槐糖脂產品。

（1）通量（J）的測定[18]以0.1MPa 的壓力過膜超濾，預壓15min后，收集一定時間內通過膜的溶劑體積。計算見式(1)。

（2）截留率（R）的測定[18]將經(jīng)過處理工藝的槐糖脂濾液，以0.1MPa 的壓力過膜超濾，被膜截留的溶質占溶液中該溶質總量的百分比即為截留率。計算見式(2)。

式中，C1為透過液的濃度；V1為透過液的體積；C0為物料的進料濃度；V0為物料的進料體積。

1.2.5 槐糖脂產量的測定[4]

DNS 法測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量，蒽酮-硫酸法測定發(fā)酵液中槐糖脂的總含量。

1.2.6 槐糖脂的純度測定[23]

將上樣溶液用0.22μm 的微孔濾膜進行過濾，濾后使用HPLC 分析其主要組成和純度?；碧侵琀PLC 檢測條件：色譜柱為KromasiL C18分析柱（5μm×250nm×4.6mm，Agela Technologies Inc.）；流動相為乙腈-水；檢測波長為207nm；進樣體積為20μL；流速為1mL/min。梯度洗脫（體積分數(shù)）：0～15min乙腈含量從40%升高至60%，15～30min乙腈含量從60%升高至70%，35～40 min 乙腈含量從70%升高至90%，40～55min乙腈含量維持90%。

2 結果與討論

槐糖脂發(fā)酵液的預處理與不同結構槐糖脂的分離方法，包括以下步驟：①槐糖脂發(fā)酵液的預處理，包括高溫滅菌、自然冷卻、自然沉降等程序；②下層內酯型槐糖脂的收集與處理；③上層發(fā)酵液中菌絲體的過濾去除；④除雜處理，包括樹脂吸附和超濾處理，用以除色素、除鹽、除蛋白等；⑤納濾濃縮至所設定的酸型槐糖脂濃度；⑥干燥，將步驟②和步驟⑤中所得不同結構的槐糖脂產品烘干得到不同固體槐糖脂產品。

2.1 發(fā)酵液的預處理

由于菌體在厭氧條件下會分解產物，因此發(fā)酵結束后需對菌體進行滅活處理。菌體在高溫下無法生存，但溫度過高會造成升溫所帶來的能耗過大以及后續(xù)降溫時間的延長等問題，因此發(fā)酵結束后，將溫度升高到50℃進行滅菌處理40min[23]，然后自然降溫1.5h 使升溫帶來的熱量自然散失，自然降溫可以使溫度緩慢降低，在一定時間內繼續(xù)滿足滅菌的需求，且無需產生額外的能源消耗和經(jīng)濟成本。同時關閉攪拌和降低空氣流量，發(fā)酵液中泡沫消去，內酯型槐糖脂自然沉降，與菌體和剩余的菜籽油分離開來。由于密度不同，內酯型槐糖脂沉淀在底部，菌體層在中間，部分與內酯型槐糖脂混合，殘余的菜籽油在頂部，有些出現(xiàn)了乳化現(xiàn)象。將發(fā)酵液收集到細長形圓柱狀的容器中，下接高30cm、直徑2.5cm 的細長玻璃柱，細長玻璃柱底面積小且具有可視性，一方面便于內酯型槐糖脂的富集，易于分離；另一方面可肉眼觀察到分離出內酯型槐糖脂的界線，因此，使得后續(xù)的分離及收集更為方便。靜置20min后收集下層黏稠狀內酯型槐糖脂。

2.2 菌絲體的過濾去除

2.2.1 助濾劑添加量的選擇

考察了助濾劑硅藻土的添加量對槐糖脂發(fā)酵液濁度、槐糖脂回收率及發(fā)酵液蛋白含量的影響，結果如圖1所示。

通過圖1可以發(fā)現(xiàn)，助濾劑硅藻土的添加量對濁度的影響較大。當助濾劑硅藻土的添加量為0.5%時，與原發(fā)酵液相比，濁度降低了67.53%（為8.32NTU），但發(fā)酵液蛋白含量和槐糖脂含量并沒有明顯變化，因此可以認為助濾劑的添加可以很大程度上將菌絲體濾除，但是對一些無機鹽，可溶性蛋白及其他物質過濾效果較差。當硅藻土的添加量達到1.0%時，硅藻土添加量的增大對濁度的降低影響有限，且會導致槐糖脂含量降低。因此，考慮到經(jīng)濟成本以及目標物質的獲得，本研究選擇1.0%的硅藻土添加量作為本實驗的最佳助濾劑添加量。

圖1 助濾劑添加量對過濾效果的影響

2.2.2 板框過濾濾布層數(shù)的選擇

確定硅藻土的添加量為1.0%后，考察了濾布的層數(shù)對槐糖脂回收率、菌體與菌液分離效果及發(fā)酵液蛋白含量的影響，結果如表1所示。

表1 濾布層數(shù)對過濾效果的影響

結果顯示：隨著濾布的增多，濁度逐漸下降，說明發(fā)酵液中的不溶性固體顆粒有所減少。但隨著更多濾布層數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)槐糖脂的含量也隨之降低，即槐糖脂回收率逐漸降低；且過濾速率也隨之降低，過濾時間延長，能耗增加。除此之外，發(fā)酵液中蛋白含量很低，板框過濾對其幾乎沒有影響。因此，考慮到經(jīng)濟成本以及槐糖脂回收率，本研究選擇4 層濾布作為本實驗的最佳濾布層數(shù)。

2.3 除雜處理

將濾后的發(fā)酵液進行脫色、脫鹽、脫蛋白處理[16]，考察了不同樹脂對槐糖脂發(fā)酵液的處理效果，結果如表2所示。

表2 樹脂對發(fā)酵液的除雜效果

將過濾之后的槐糖脂含量為64.73g/L的發(fā)酵液依次進樣到陽離子交換樹脂783、陰離子交換樹脂767 以及大孔吸附樹脂DM700 中，經(jīng)過樹脂處理后，發(fā)酵液的透光率達到87.41%。而在槐糖脂回收率方面，經(jīng)過陽離子交換樹脂的槐糖脂濃度為63.48g/L，流經(jīng)陰離子交換樹脂的槐糖脂濃度為62.02g/L，流經(jīng)大孔吸附樹脂的槐糖脂濃度為60.79g/L， 回 收 率 分 別 為98.07%、 97.70%、98.02%。濾后發(fā)酵液流經(jīng)整個除雜樹脂后，槐糖脂總回收率為93.91%，截留率為6.09%，工業(yè)上在可以接受的回收率范圍內。

2.4 超濾-納濾濃縮工藝

預處理后的槐糖脂發(fā)酵液，經(jīng)過除雜樹脂后，仍然可能存在無機鹽、小分子物質以及殘留底物等[18]。如果此時直接進行納濾濃縮，一方面會導致物質的純度較低，另一方面會導致納濾堵塞，污染，設備損壞。因此本研究首先利用超濾系統(tǒng)對其進行進一步除雜，再利用納濾進行濃縮，以得到含量較高、雜質較少的槐糖脂產品。此外，為了去除納濾液中的部分水分，得到含水量較低的產品，對納濾處理后的發(fā)酵液進行了旋轉蒸發(fā)操作。

2.4.1 超濾膜通量隨著時間的變化

超濾處理工藝確定過程中，考察了隨著時間的延長，超濾膜通量的變化情況，結果如圖2所示。

圖2 超濾膜通量隨時間的變化情況

由圖2可以看出，隨著時間的延長，超濾膜通量隨之下降，但下降趨勢并不明顯，不影響超濾的正常進行。30L 槐糖脂含量為60.79g/L 的發(fā)酵液經(jīng)過超濾處理后，得到35L 槐糖脂含量為46.92g/L 的超濾液。槐糖脂回收率為90.05%。

2.4.2 納濾濃縮效果分析

將超濾液進行納濾濃縮，共獲得4L 濃度為346.8g/L 的槐糖脂納濾濃縮液，槐糖脂回收率為84.47%，濃縮效果優(yōu)良。根據(jù)需求，可將所得濃縮納濾液再經(jīng)旋轉蒸發(fā)去除殘留水分，獲得深褐色黏稠狀槐糖脂產品。

2.5 純化后槐糖脂純度的比較測定

為了考察獲得的不同結構的槐糖脂的純度，本研究將發(fā)酵得到的總槐糖脂、分離純化后得到的內酯型槐糖脂、酸型槐糖脂及某市售槐糖脂產品進行了HPLC分析，結果如圖3所示。

從4種槐糖脂的高效液相圖譜可以看出，處理后槐糖脂樣品的雜質峰較少，酸型槐糖脂在10min內基本出峰完畢，圖譜中未出現(xiàn)內酯型槐糖脂對應的特征峰[圖3(a)]；內酯型槐糖脂的組分多些，但主要組分的保留時間分別為27min 和32min，且其圖譜中酸型槐糖脂對應的特征峰較少[圖3(b)]；這兩者均說明本文所述方法取得的分離純化效果較好?？偦碧侵腍PLC圖譜中，酸型槐糖脂和內酯型槐糖脂的組分對應的保留時間及峰形與前述兩種槐糖脂的HPLC圖譜一致，且兩種槐糖脂組分的特征峰能很好地分離[圖3(c)]。而目前市售槐糖脂產品主要為酸型槐糖脂和內酯型槐糖脂的復雜混合物，組分較為復雜。HPLC 圖譜則顯示其含有大量的極性較強、結構未知的雜質峰[圖3(d)]。

表3 中比較了上述4 種樣品所含不同槐糖脂分子的峰面積的百分比?？梢钥闯觯诒狙芯刻幚砉ば驐l件下，所得內酯型槐糖脂的純度為84.47%，酸型槐糖脂的純度為99.46%；總槐糖脂產品中內酯型和酸型槐糖脂的含量分別為67.38%、32.62%；市售產品中內酯型槐糖脂的含量為50.18%，酸型槐糖脂的含量為49.82%。上述數(shù)據(jù)顯示，利用本方法可以達到對槐糖脂發(fā)酵液進行分離純化，獲得不同槐糖脂產品的目的，且不同類型槐糖脂產品的純度優(yōu)于市售產品。

3 結論

本研究基于槐糖脂發(fā)酵液的理化指標和特性，以工廠現(xiàn)有設備為基礎，分別利用自然沉降法和板框過濾-樹脂吸附-超濾納濾濃縮法成功獲得內酯型槐糖脂和酸型槐糖脂產品。

圖3 酸型槐糖脂、內酯型槐糖脂、總槐糖脂及某市售槐糖脂的HPLC圖譜分析比較

優(yōu)化確定板框過濾過程中的濾布層數(shù)以及助濾劑硅藻土的添加量后，本研究采用的超濾-納濾的濃縮方法可以進一步去除經(jīng)樹脂吸附處理后的發(fā)酵液中仍存在的一些不溶性物質和減少發(fā)酵液的體積。

表3 不同槐糖脂產品的純度比較分析表

HPLC 圖譜表明，經(jīng)分離純化后，兩種槐糖脂的純度達到了很高的水平，說明本法可以對槐糖脂發(fā)酵液進行分離純化，獲得不同的槐糖脂產品，且獲得產品的標準均達到市售標準，質量優(yōu)于市售產品。此分離方法豐富了槐糖脂類產品的品種，填補了市售產品均為內酯型和酸型槐糖脂混合物的缺陷，使得不同類型的槐糖脂產品具有更具針對性、更為清晰和明確的應用方向。另外，該分離純化工藝可以減少或去除有機試劑的使用，處理過程不涉及化學反應，提高了槐糖脂生產的安全性與環(huán)保性。

本研究隨后的中試生產中，自然冷卻法被用于降低高溫滅菌后的發(fā)酵液的溫度，旋蒸法被用于脫去納濾濃縮后發(fā)酵液的殘余水分，但這兩種方法的冷卻效率和濃縮效率均較低，在槐糖脂的工業(yè)化生產中將采用冷卻塔冷卻和薄膜蒸發(fā)濃縮的方法替代上述兩種方法，以提高槐糖脂的生產效率。