楊文博，姚曉光，木拉力別克·黑扎提，王磊，邵亮，李南方

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000； 2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓中心 新疆高血壓研究所，烏魯木齊 830001)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是一種以睡眠時(shí)上氣道口咽水平反復(fù)塌陷，進(jìn)而出現(xiàn)周期性呼吸暫停及低通氣為特征的常見睡眠障礙性疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，OSA與高血壓、冠心病、糖尿病、脂質(zhì)代謝紊亂等疾病有關(guān)，在女性中發(fā)病率為4%～9%，男性中為9%～24%[2-3]。目前認(rèn)為上氣道炎癥是OSA發(fā)病的主要原因，但OSA病因復(fù)雜，具體的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚[4-5]。人類口腔中存在大量微生物，人與口腔微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了相對(duì)穩(wěn)定的共生狀態(tài)，這些微生物參與調(diào)節(jié)口腔黏膜穩(wěn)態(tài)免疫，并與多種局部及全身性系統(tǒng)疾病有關(guān)[6-8]。口咽作為上氣道的中部，是OSA患者睡眠過程中反復(fù)塌陷的部位，也是存在大量炎癥的部位[4,9]。觀察OSA患者口咽局部菌群的多樣性及組成變化，研究口咽局部菌群的多樣性及組成變化與OSA的關(guān)系可能為研究OSA的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。本研究采用目前高效準(zhǔn)確的二代測(cè)序方法16S rDNA測(cè)序[10-11]探測(cè)中重度OSA患者的局部菌群多樣性及組成，繼而探討口咽菌群與OSA之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年4—12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓中心住院完成多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)并同意提供咽拭子標(biāo)本的51例男性疑診OSA(無誘因白天嗜睡者，本人、家人或同病房患者述有夜間打鼾)患者為研究對(duì)象。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肌梗死或腦卒中<6個(gè)月等心腦血管疾??；糖尿病、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌疾病，急慢性呼吸道疾病；全身炎癥性疾?。?周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素、抗生素或其他抗炎類藥物，中樞性睡眠呼吸暫停，輕度OSA及嗜酒患者。上述患者根據(jù)睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(apnea hypopnea index，AHI)[12]分為三組：非OSA(AHI<5)組(n=25)、中度OSA(15≤AHI<30)組(n=15)和重度 OSA(AHI≥30)組(n=11)。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè) 睡眠監(jiān)測(cè)采用澳大利亞Compumedics公司生產(chǎn)的44道睡眠監(jiān)測(cè)儀。軟件為Profusion PSG睡眠分析軟件，所有研究對(duì)象均完成夜間連續(xù)7 h以上的睡眠監(jiān)測(cè)。

1.3生化指標(biāo)測(cè)定 所有研究對(duì)象在完成多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)次日8：00抽取外周靜脈血進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定，包括總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、C反應(yīng)蛋白。

1.4咽拭子標(biāo)本的采集 在多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)完成后次日清晨進(jìn)行咽拭子標(biāo)本采集，所有研究對(duì)象均禁止刷牙、漱口、吃早餐，用潔凈的咽拭子來回擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁。咽喉取樣時(shí)，拭子不能接觸到牙齒、口腔和舌黏膜，然后將拭子頭浸入采樣液中，尾部棄去，擰緊蓋子。標(biāo)本收集完后，將標(biāo)本放在-80 ℃的冰箱中保存。

1.5細(xì)菌DNA的提取及測(cè)序 將采集好的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，對(duì)DNA樣品進(jìn)行濃度、片段分布、OD260/280和OD260/230檢測(cè)，將高質(zhì)量樣本進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。對(duì)高質(zhì)量樣品構(gòu)建文庫，數(shù)據(jù)處理過濾時(shí)濾除低質(zhì)量的reads，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags，然后通過UPARSE-OTU算法按照97%相似度為分界聚類出一系列OTU，生成OTU的代表序列。通過RDP classifer軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行物種注釋。首先對(duì)得到的OTU進(jìn)行細(xì)菌注釋分類，然后對(duì)各個(gè)檢測(cè)標(biāo)本做出多樣性指數(shù)ace稀釋曲線圖，在目分類水平做出細(xì)菌相對(duì)豐度點(diǎn)線圖，對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行組內(nèi)多樣性及物種構(gòu)成分析。使用R(v3.0.3)軟件繪制OTU Rank曲線來初步衡量樣本中所含物種的豐富程度和均勻程度。

2 結(jié) 果

2.1三組一般資料比較 三組年齡、吸煙率、體質(zhì)指數(shù)、腹圍、總的睡眠時(shí)間、睡眠效率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三組最低血氧飽和度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中度和重度OSA組最低血氧飽和度低于非OSA組，重度OSA組低于中度OSA組(P<0.05)。見表1。

2.2三組生化指標(biāo)比較 三組總膽固醇、空腹血糖、C反應(yīng)蛋白比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三組三酰甘油比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中度和重度OSA組三酰甘油高于非OSA組，重度OSA組高于中度OSA組(P<0.05)。見表2。

2.3測(cè)序深度及物種豐富度、均勻度分析 ace指數(shù)在抽取到10 000個(gè)測(cè)序序列時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，不隨抽取序列數(shù)的增加而增加，更多的測(cè)序序列對(duì)多樣性指數(shù)ace的增加貢獻(xiàn)少，樣本測(cè)序的結(jié)果足以捕獲微生物的多樣性，見圖1。40個(gè)高質(zhì)量樣本(其中非OSA組14例，中度OSA組15例，重度OSA組11例)共產(chǎn)生461種OTU。在豐度上，大多數(shù)OTU的豐度在1%以下。在均勻度上，曲線下降不平坦，各個(gè)標(biāo)本中物種的均勻度不高，優(yōu)勢(shì)菌的豐度為10%～100%，見圖2。

2.4目分類水平組內(nèi)多樣性及物種組成分析 在目分類水平上，隨著OSA程度加重，組內(nèi)多樣性逐漸降低：除未分類細(xì)菌外，非OSA組探測(cè)到37種細(xì)菌，中度OSA組探測(cè)到33種，重度OSA組32種。所有樣本均以擬桿菌目、梭菌目、奈瑟菌目、梭桿菌目、乳酸桿菌目、巴斯德菌目占主導(dǎo)地位。其中，中度、重度OSA組奈瑟菌比例均明顯升高，見圖3。

2.5目分類水平菌群組間多樣性分析 中度OSA組未檢測(cè)到鏈球菌目，重度OSA組未檢測(cè)到紅桿菌目，中度及重度OSA組均未檢測(cè)到不等鞭毛菌目；與非OSA組相比，中度OSA組和重度組腸桿菌目豐度明顯降低(Pfdr<0.05)，重度OSA組海洋螺菌目、交替單胞菌目豐度明顯降低(Pfdr<0.05)，中度OSA組柄桿菌目豐度明顯降低(Pfdr<0.05)；中度OSA和重度OSA組間多樣性相似，未發(fā)現(xiàn)差異細(xì)菌。見表3。

2.6差異菌與OSA及臨床資料的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：腸桿菌目、海洋螺菌目、交替單胞菌目、紅桿菌目、不等鞭毛菌目的豐度與AHI呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，鏈球菌目、柄桿菌目的豐度與AHI無相關(guān)性(P>0.05)；除柄桿菌目的豐度與體質(zhì)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)外，其他差異菌與體質(zhì)指數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)；各差異菌豐度與年齡無相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表1 非OSA組與中度、重度OSA組一般資料比較

表2 非OSA組與中度、重度OSA組

Number of sequences sampled:抽取的Tag數(shù)量；Rarefaction Measure:ace:ace指數(shù)測(cè)量值；A：非OSA組；B：中度OSA組；C：重度OSA組

Relative abundance：OTU的相對(duì)豐度；Number of OTUs：OTU的豐度排序；A：非OSA組；B：中度OSA組；C：重度OSA組

OSA:阻塞性睡眠呼吸暫停；其他：物種豐度在所有樣品低于0.5%的物種

表3 三組目分類水平菌群組間多樣性比較

表4 差異菌與AHI、體質(zhì)指數(shù)及年齡的相關(guān)性分析

3討 論

口腔微生物組成復(fù)雜,種類繁多，在美國(guó)國(guó)立口腔與頜面研究所建立的人體口腔微生物組數(shù)據(jù)庫中共記錄了13個(gè)細(xì)菌門，約700種人類口腔微生物[13]?？谇簧鷳B(tài)系統(tǒng)的平衡對(duì)人類健康有重要影響。研究OSA與口腔局部菌群之間的關(guān)系，維護(hù)菌群的動(dòng)態(tài)平衡意義重大。本研究采用目前成熟、高效的第二測(cè)序技術(shù)(16S rDNA測(cè)序)分析了OSA患者的口咽微生物組成及與OSA之間的關(guān)系。

OSA患者因睡眠時(shí)反復(fù)出現(xiàn)上氣道的部分或完全塌陷，睡眠過程中鼻腔氣流減少，引起打鼾及張口呼吸[14]，使得口腔直接暴露在灰塵、顆粒物和各種空氣微生物中，加之夜間反復(fù)的氣道內(nèi)壓力的劇烈變化及經(jīng)鼻氣流的減少使氣道內(nèi)氣體濕度與含氧量下降，口咽的微生物因微環(huán)境改變而受到影響[15]。因此，OSA患者口咽菌群組成及多樣性改變，存在失調(diào)。

在探測(cè)到的細(xì)菌種類上，隨OSA的加重而逐漸減少。而細(xì)菌多樣性的降低通常與各種疾病相聯(lián)系，包括糖尿病、肥胖癥和慢性呼吸道疾病(如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)[16-19]。Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn)肺炎患兒的口咽及鼻咽菌群多樣性也存在降低的現(xiàn)象。同樣，腸道菌群多樣性的降低是腹瀉、炎性腸病、艱難梭菌感染等多種疾病的標(biāo)志[21]，短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌在調(diào)節(jié)腸道內(nèi)pH值、抑制炎癥反應(yīng)、建立腸道環(huán)境中起關(guān)鍵作用[22]。Wu等[23]通過對(duì)OSA患者的鼻腔灌洗液進(jìn)行微生物群及炎癥因子分析，發(fā)現(xiàn)了與OSA及炎癥標(biāo)志物相關(guān)的鼻咽微生物變化。有研究在重度OSA組中鑒定出了具有特征性的富集菌群，如鏈球菌、普雷沃菌、韋榮菌和卟啉單胞菌等，OSA組鼻腔灌洗液中的白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8水平顯著高于非OSA組；對(duì)OSA組中不同水平的IL-6和IL-8進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)，兩組鼻腔菌群的組成比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步證實(shí)了OSA患者局部菌群與炎癥之間的關(guān)系[23]?？谇桓鞣N微生物之間的平衡對(duì)氣道抵御外界病原菌有重要作用，局部微生態(tài)的改變，特別是局部菌群多樣性的降低會(huì)造成局部免疫系統(tǒng)失衡[24]，而中重度OSA人群的口咽菌群多樣性降低可能是導(dǎo)致OSA局部及系統(tǒng)炎癥的原因之一。呼吸道的特定部位定殖有相對(duì)固定的細(xì)菌群落[25]。當(dāng)菌群處于動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，氣道微生物可抵御多種病原菌的入侵和生長(zhǎng)，而這種平衡的破壞可能產(chǎn)生不良后果[26]。口咽部的定植菌有鏈球菌、奈瑟菌、羅氏菌和厭氧菌，包括韋氏菌、普雷沃特菌和韋榮球菌[25,27-28]。本研究中，隨著OSA程度的加重，奈瑟菌和梭桿菌比例增加，尤其是奈瑟菌，這可能會(huì)對(duì)局部微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡產(chǎn)生不利影響。口腔及十二指腸黏膜中奈瑟菌的過度生長(zhǎng)可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)異?；罨?，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥的產(chǎn)生[29-30]。OSA患者口腔發(fā)生的炎癥狀態(tài)可能有利于Neisseria菌株的定植，促進(jìn)Neisseria維持促炎狀態(tài)。然而，梭桿菌與疾病關(guān)系的研究有限，與OSA的關(guān)系需要深入研究。

腸桿菌作為腸道的富集菌群可通過不良的口腔習(xí)慣，如吮指等行為進(jìn)入口腔[31]，腸桿菌可作為機(jī)會(huì)致病菌引起菌血癥[32]，而腸桿菌與OSA的關(guān)系目前研究較少，值得進(jìn)一步深入研究。海洋螺菌、交替單胞菌、紅桿菌及不等鞭毛菌與OSA人群中豐度下降，且與OSA的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。然而海洋螺菌、交替單胞菌、紅桿菌及不等鞭毛菌與人體疾病或健康的研究較少見報(bào)道，這可能是未來研究的方向。

綜上所述，OSA患者口咽菌群組成改變，多樣性降低，部分菌群與OSA的嚴(yán)重性具有相關(guān)性，這為OSA患者口咽菌群失調(diào)提供了證據(jù)，為OSA的發(fā)病機(jī)制提供了新的探索方向。