姚佳，黃宇欣，高豪，汪洋

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)教研室，西安 710021)

抗菌肽，又稱為抗微生物肽、肽抗生素、宿主防御肽，是生物體特定基因編碼的一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。自發(fā)現(xiàn)天蠶素以來，目前已有超過2 900種天然抗菌肽被報(bào)道，其中76%以上來源于動(dòng)物[1]。按結(jié)構(gòu)特征的不同，動(dòng)物抗菌肽可分為殺菌肽、防御素和組織蛋白酶抑制素Cathelicidin，存在于人體的內(nèi)源性抗菌肽主要包括Cathelicidin和防御素兩類。口腔是全身細(xì)菌儲(chǔ)量僅次于腸道的微環(huán)境，在正常情況下，口腔內(nèi)的微生物與宿主之間存在著共生和拮抗的平衡關(guān)系，而存在于人體的抗菌肽在調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡、抵御病原體入侵方面發(fā)揮重要作用。作為唯一的人源Cathelicidin類抗菌肽，LL-37是人體固有免疫的重要組成部分，對(duì)于口腔健康至關(guān)重要。目前研究已發(fā)現(xiàn)LL-37與多種口腔疾病的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系?，F(xiàn)就LL-37在幾種口腔疾病發(fā)生、發(fā)展中所起的作用予以綜述，以期為口腔健康和局部微環(huán)境的維系、口腔疾病的發(fā)生發(fā)展和治療提供新思路。

1 LL-37

人源陽離子抗菌肽-18(human cationic antimicrobial peptide-18，hCAP-18)是目前已發(fā)現(xiàn)的唯一人源Cathelicidin類抗菌肽。hCAP-18可由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)，但在炎癥、感染等情況下表達(dá)明顯增加，具有放大Toll樣受體信號(hào)的功能，其通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜滲透壓而使細(xì)菌死亡，并參與宿主的防御反應(yīng)[2-3]。

在正常情況下，hCAP-18在細(xì)胞內(nèi)以無活性的前肽形式被合成和儲(chǔ)存，其基因啟動(dòng)子區(qū)域含有一個(gè)白細(xì)胞介素-6核因子的識(shí)別位點(diǎn)，白細(xì)胞介素-6可能通過蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路或大鼠肉瘤病毒蛋白/促分裂原活化的蛋白激酶級(jí)聯(lián)活化白細(xì)胞介素-6核因子，從而激活hCAP-18基因的表達(dá)。hCAP-18的前肽包含一個(gè)信號(hào)肽、Cathelin保守區(qū)以及C端的功能區(qū)，分子量約為19 300。在受到外界刺激后，hCAP-18可由胞內(nèi)釋放至胞外，并在這一過程中去掉信號(hào)肽，成為分子量約為18 000的hCAP-18，再經(jīng)絲氨酸蛋白酶3作用剪切掉Cathelin保守區(qū)，釋放出C端具有活性的小分子多肽，該小分子多肽由37個(gè)氨基酸構(gòu)成，因其N端前兩位為亮氨酸故被研究者們稱為LL-37[4]。

2 LL-37與常見口腔疾病

口腔是消化系統(tǒng)的起始部分，口腔健康可以直接或間接地影響全身健康，世界衛(wèi)生組織早已將口腔健康定為人體健康十大標(biāo)準(zhǔn)之一。口腔內(nèi)適宜的溫度、濕度和營養(yǎng)源為微生物提供了良好的定植環(huán)境，使得口腔成為人體內(nèi)僅次于腸道的微生物聚集場所。這些微生物之間、微生物和宿主免疫系統(tǒng)之間保持著微妙的微生態(tài)平衡，維系著口腔的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，并抵御外界不良因素對(duì)機(jī)體的侵襲。作為固有免疫的重要組成部分，LL-37可在低水平下發(fā)揮抗感染、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等重要作用，參與口腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和口腔微生態(tài)的平衡。當(dāng)口腔中LL-37的表達(dá)出現(xiàn)異常，微生態(tài)平衡被打破時(shí)，可導(dǎo)致諸如齲病、牙周炎以及黏膜潰瘍等口腔疾病[5]。

2.1齲病 齲齒是一種口腔常見的細(xì)菌性疾病，也是學(xué)齡前兒童牙齒缺損的常見原因。根據(jù)全國第四次口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，12歲兒童恒牙患齲率為34.5%，5歲兒童乳牙患齲率為70.9%[6]。唾液中抗菌肽含量與兒童齲齒的相關(guān)性很早即被研究者發(fā)現(xiàn)。

Ribeiro等[7]對(duì)106名兒童的唾液肽進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，口腔中的α-防御素3和β-防御素3均能降低早期幼兒齲齒的發(fā)病率。Colombo等[8]研究也指出，LL-37在齲齒兒童唾液中的表達(dá)與β-防御素2/3呈正相關(guān)。

變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是口腔中常見的微生物，因其具有容易形成生物膜的特點(diǎn)，故有助于牙菌斑的形成。長期研究證明，S.mutans在口腔中的水平與齲壞的程度呈正相關(guān)[9]。Malcolm等[10]對(duì)57名12～24月齡的兒童進(jìn)行了牙菌斑和唾液的收集，并在3歲時(shí)對(duì)其中23人進(jìn)行了復(fù)檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長，LL-37和S.mutans 的水平均升高，且在S.mutans感染最嚴(yán)重的兒童唾液中，LL-37的水平最高。但這種情況并不能說明口腔中水平升高的LL-37刺激了S.mutans的生長；作為重要的口腔抗菌肽，LL-37可與S.mutans脂磷壁酸相互作用，從而影響S.mutans的吸附，抑制其生物被膜的形成，減少牙菌斑的產(chǎn)生[11-12]。此外，LL-37還可以通過“地毯式”殺傷模式造成口腔內(nèi)其他病原性細(xì)菌的死亡，LL-37在這些細(xì)菌表面聚集，以α-螺旋插入細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜的完整性，引起細(xì)菌死亡，這些功能均有助于減少齲壞的形成[12]?？梢姡?dāng)口腔中S.mutans數(shù)量升高，形成牙菌斑造成齲壞時(shí)，LL-37及口腔中其他唾液肽的表達(dá)也一同增加，聯(lián)合發(fā)揮抗菌作用抑制S.mutans的生長，維系口腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]。

但在嚴(yán)重齲壞的兒童唾液中，高水平的LL-37和其他唾液肽卻無法阻止牙菌斑和齲壞的發(fā)生，Phattarataratip等[14]通過分析此現(xiàn)象的原因發(fā)現(xiàn)，來自活動(dòng)齲患兒的S.mutans菌株對(duì)唾液中α-防御素1/2、β-防御素2/3和LL-37的耐藥性均顯著高于無齲者。

通過上述研究可見，在正常情況下，LL-37聯(lián)合口腔中多種唾液肽(α-防御素1/2、β-防御素2/3等)對(duì)口腔中微生態(tài)平衡的調(diào)控及致病菌感染的清除起到積極的促進(jìn)作用，但S.mutans、遠(yuǎn)緣鏈球菌等病原體也可以通過產(chǎn)生耐藥性變異來逃逸LL-37及其他唾液肽的殺傷，從而定植于牙齒表面形成牙菌斑，造成牙齒的嚴(yán)重齲壞。

2.2牙周病 牙周病指的是發(fā)生于牙齦、牙周膜等牙齒支持組織的慢性炎癥性疾病。牙周病是常見的口腔疾病，也是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一。牙周病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但學(xué)者認(rèn)為，菌斑微生物黏附在牙齒表面后與宿主發(fā)生的免疫反應(yīng)是造成牙周組織病變的主要原因[15]，作為口腔中參與感染免疫的重要抗菌肽，LL-37憑借其抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用，及時(shí)有效地識(shí)別并殺滅牙周致病微生物，也可以通過中和細(xì)菌內(nèi)毒素減少其對(duì)牙周組織的破壞，達(dá)到保護(hù)牙周組織的目的[16]。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)，LL-37與牙周病的發(fā)生發(fā)展之間存在密切聯(lián)系[17-21]。

Hosokawa等[17]研究發(fā)現(xiàn)無論是否存在炎癥，牙齦上皮細(xì)胞均可表達(dá)β-防御素2/3和LL-37。他們通過免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法分析牙齦組織中的唾液肽發(fā)現(xiàn)，在牙周炎患者的牙齦炎癥組織中，中性粒細(xì)胞僅表達(dá)LL-37而不產(chǎn)生β-防御素2/3，且相對(duì)于健康的牙齦，炎癥組織中LL-37的表達(dá)水平明顯升高，牙周損傷越嚴(yán)重，牙齦縫隙深度越大，而牙齦組織勻漿中LL-37的水平與牙齦縫隙深度呈正相關(guān)。

Puklo等[21]利用免疫印跡比較了慢性牙周炎和侵襲性牙周炎患者及健康人群齦溝液樣本中LL-37的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者的LL-37水平最高，侵襲性牙周炎患者次之，而健康人群齦溝液中的LL-37多以hCAP-18的前體形式存在；同時(shí)，除hCAP-18和LL-37外，在齦溝液樣本中還檢出另外一種分子量為11 000的蛋白。有研究通過分析LL-37與牙周菌斑中特異致病菌間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，該分子量為11 000的蛋白條帶與牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體細(xì)菌的蛋白水解酶有關(guān)，該酶可降解 hCAP-18，形成分子量為11 000的蛋白[20-21]。

Eick等[22]發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，掌跖角化-牙周破壞綜合征患者更易罹患重度牙周炎，且在掌跖角化-牙周破壞綜合征牙周炎患者齦溝液中雖然含有高表達(dá)水平的hCAP-18，但LL-37無法檢出。這是因?yàn)檎契沤腔?牙周破壞綜合征患者體內(nèi)存在功能失調(diào)的組織蛋白酶C和絲氨酸蛋白酶3，而缺乏絲氨酸蛋白酶3將導(dǎo)致hCAP-18無法被剪切成為成熟的LL-37[23]；在口腔抗菌肽缺乏的情況下，口腔致病菌(如伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌等)較易感染牙齦和牙周組織，最終發(fā)展為牙周疾病[24]。

可見，在健康情況下LL-37多以前體hCAP-18的形式存在于各類免疫細(xì)胞中，在遭遇感染引起炎癥時(shí)，以中性粒細(xì)胞為主的各類免疫細(xì)胞向炎癥發(fā)生部位遷移，hCAP-18水解形成具有活性的LL-37并釋放至炎癥發(fā)生部位，隨著LL-37水平升高發(fā)揮抗菌及中和脂多糖毒性的作用，口腔牙周病情況好轉(zhuǎn)，各種炎癥反應(yīng)減輕趨向恢復(fù)；但口腔中存在的致病微生物也可以產(chǎn)生蛋白酶水解hCAP-18，使其形成LL-37的量減少，以利于這些致病微生物的定居和侵襲。

2.3口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP) OLP是一種伴有慢性淺表性炎癥的黏膜角化異常性疾病，是口腔黏膜病中最常見的疾病之一，目前病因尚不明確，但有數(shù)據(jù)表明其可能與精神因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素、病原微生物感染因素有關(guān)[25-27]。

Davidopoulou等[28]通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)了健康受試者和OLP患者唾液中LL-37的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康受試者唾液中LL-37的平均水平約為30.5 ng/mL，而網(wǎng)型、糜爛型(輕度)、糜爛型(重度)OLP患者分別為34、64、68.5 ng/mL，顯著高于健康受試者，給予皮質(zhì)激素治療后患者唾液中LL-37的水平均顯著下降，且隨著唾液LL-37水平的降低，病灶的臨床外觀改善。

鄒杰[29]采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈技術(shù)檢測(cè)了25例OLP患者的病變黏膜組織和14例健康個(gè)體黏膜組織中的LL-37水平及其信使RNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LL-37在健康個(gè)體的正?？谇火つそM織中也有少量表達(dá)，但在OLP病損組織中表達(dá)量明顯升高，提示LL-37可能因炎癥誘導(dǎo)而參與OLP的發(fā)生發(fā)展；且采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定定量分析OLP患者口腔中LL-37水平，也發(fā)現(xiàn)在重度OLP患者唾液中LL-37水平顯著高于健康者。

目前已有研究證實(shí)，幽門螺桿菌、白色念珠菌等病原微生物的感染與OLP發(fā)病關(guān)系密切[30]。Hase等[31]研究發(fā)現(xiàn)，皮膚以及消化道黏膜在受到幽門螺桿菌、潰瘍分枝桿菌等病原微生物刺激時(shí)，除中性粒細(xì)胞外，上皮細(xì)胞也可以通過Toll樣受體2/4旁路刺激釋放LL-37、β-防御素2/3發(fā)揮局部免疫作用。Ren等[32]報(bào)道，LL-37在結(jié)直腸癌細(xì)胞中可通過G蛋白偶聯(lián)受體-p53-Bcl-2相關(guān)X蛋白/Bak/Bcl-2的級(jí)聯(lián)活化，在線粒體膜間蛋白凋亡誘導(dǎo)因子作用下，使核酸內(nèi)切酶G進(jìn)入細(xì)胞核，引起DNA片段化，促使結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，且該凋亡過程并不依賴傳統(tǒng)的胱天蛋白酶途徑?？梢姡?dāng)口腔內(nèi)發(fā)生幽門螺桿菌、白色念珠菌等病原微生物的感染時(shí)，炎癥部位趨化的中性粒細(xì)胞、局部的黏膜上皮細(xì)胞可以通過產(chǎn)生成熟的LL-37去殺滅這些病原體來維護(hù)口腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但產(chǎn)生LL-37是否可通過非胱天蛋白酶依賴途徑介導(dǎo)OLP中基底細(xì)胞凋亡從而加重OLP的進(jìn)一步發(fā)展，仍有待研究證實(shí)。

LL-37作為機(jī)體先天性免疫的重要組成部分，在維系口腔黏膜健康中具有一定的積極作用。但在OLP的發(fā)展病理過程中，LL-37表達(dá)量明顯升高，且在治療過程中伴隨LL-37水平降低，OLP的病灶外觀也發(fā)生改善，說明LL-37極有可能促進(jìn)了OLP的發(fā)病過程，但具體機(jī)制尚未闡明。

2.4口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC) 在世界范圍內(nèi)，口腔腫瘤發(fā)病率占所有惡性腫瘤的3%左右，口腔腫瘤中最常見的細(xì)胞來源是鱗狀細(xì)胞，其在口腔腫瘤中占的比例超過90%[33]。

Okumura等[34]研究發(fā)現(xiàn)，來自hCAP-18 C端的27肽“hCAP-18109-135”及LL-37可在體外通過非胱天蛋白酶依賴途徑誘導(dǎo)OSCC 細(xì)胞SAS-H1凋亡，而在健康人牙齦成纖維細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞中并未出現(xiàn)此現(xiàn)象。Li等[35]研究也發(fā)現(xiàn)，LL-37的衍生物FK-16在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)口腔上皮癌敏感細(xì)胞株與多藥耐藥細(xì)胞株具有良好的殺傷作用。

Chen等[36]對(duì)70個(gè)OSCC組織和20個(gè)正常組織中的hCAP-18/LL-37進(jìn)行了免疫組織化學(xué)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hCAP-18/LL-37可在正?？谇火つぶ斜磉_(dá)，而在OSCC中弱表達(dá)，且LL-37的表達(dá)水平與腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，相較正常外周紅細(xì)胞及人角質(zhì)形成細(xì)胞，OSCC細(xì)胞HSC-3/HSC-4中hCAP-18的啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)甲基化水平明顯升高，給予去甲基化藥物5-Aza-CdR處理HSC-3/HSC-4細(xì)胞后，細(xì)胞中hCAP-18/LL-37的表達(dá)水平升高[36]。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，A?il等[37]將12只裸鼠分組，將人鱗狀上皮舌癌細(xì)胞SCC-4施用于裸鼠口腔構(gòu)建OSCC模型，使用LL-37衍生物KI-21-3定期注射。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的平均腫瘤質(zhì)量低于對(duì)照組；在免疫組織化學(xué)分析中，對(duì)照組的腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67達(dá)到了Ki-21-3注射組的4倍，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組增加2.5倍。

通過以上研究可知，hCAP-18/LL-37及其衍生物可促使OSCC細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與Ren等[32]在結(jié)直腸癌中觀察到的作用一致。作為固有免疫的重要組成部分，hCAP-18/LL-37及其衍生物在OSCC的發(fā)展過程中起重要的抑癌作用，但在OSCC患者體內(nèi)，癌細(xì)胞也可以通過提高h(yuǎn)CAP18啟動(dòng)子甲基化水平的方式來限制LL-37的表達(dá)，從而促進(jìn)OSCC的發(fā)生和發(fā)展。

3 小 結(jié)

LL-37在維系口腔健康方面發(fā)揮重要作用，其在齲齒、牙周病及OLP患者口腔中的表達(dá)上調(diào)，而在OSCC患者中下調(diào)；LL-37可通過影響S.mutans的吸附減少牙菌斑的形成，從而減少齲壞，也可以在口腔中發(fā)揮抗菌及中和脂多糖的作用來緩解牙周炎癥，且通過非胱天蛋白酶依賴途徑誘導(dǎo)OSCC 細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果均證實(shí)，LL-37與這些口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展存在密切聯(lián)系。但目前對(duì)LL-37在口腔健康方面的研究開展并不充分，很多研究仍停留在臨床樣本分析和體外實(shí)驗(yàn)階段。而口腔潰瘍病、口臭、壞疽性口腔炎等疾病與LL-37之間是否相關(guān)、具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。隨著人們對(duì)LL-37研究的不斷深入，LL-37將為口腔疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床治療研究開辟新思路。