陶 燕，李蘭蘭，盧建中，劉善輝，付生軍，張 靜

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省泌尿系臨床醫(yī)學(xué)中心，甘肅 蘭州 730030)

膀胱癌(bladder cancer，BLCA)是全球常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)膀胱癌預(yù)計(jì)占所有新發(fā)癌癥病例的5%，占所有癌癥死亡人數(shù)的3%；預(yù)計(jì)2020 年膀胱癌發(fā)病率占泌尿系癌癥的第2 位；膀胱癌患者的5 年存活率僅為14%[1]。膀胱癌一般分為兩類(lèi)：淺表性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。盡管目前可用根治性膀胱切除術(shù)和新輔助化療治療膀胱癌，但由于其復(fù)發(fā)性高，預(yù)后依然比較差[2]。因此，迫切需要尋找對(duì)膀胱癌診斷和治療更有效的生物標(biāo)志物。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白O亞族(subfamily O of forkhead box transcription factors，F(xiàn)OXO)通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的特異性激活參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、能量代謝及腫瘤發(fā)生，F(xiàn)OXO 功能失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控和DNA 損傷積累，從而產(chǎn)生致癌作用[3]。其中FOXO3(或FOXO3a)是FOXO 亞家族中的重要成員之一，其與細(xì)胞凋亡、自噬、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化、機(jī)體代謝和免疫應(yīng)答等有重要關(guān)系[4]。研究表明FOXO3在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，并與惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[5-7]。本研究通過(guò)多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘FOXO3 在膀胱癌中的表達(dá)及相關(guān)信息，以探討其在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 GEPIA數(shù)據(jù)收集與分析

通過(guò)GEPIA 基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)[8]分析 FOXO3 在膀胱癌中的表達(dá)情況。GEPIA 是基于癌癥基因組圖譜(TCGA)和GTEx項(xiàng)目的9 736個(gè)腫瘤樣本和8 587個(gè)正常樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)也可以進(jìn)行一般的生存曲線(xiàn)分析，包括總生存率(overall survival，OS)和無(wú)疾病生存率(disease-free survival，DFS)。此外GEPIA 還可以分析目標(biāo)基因與某些免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)[9]分析FOXO3 在膀胱癌中的表達(dá)以及FOXO3 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。UALCAN 是一個(gè)有效的癌癥數(shù)據(jù)在線(xiàn)分析和挖掘的數(shù)據(jù)庫(kù)，主要是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析

通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[10]中的基因模塊分析膀胱癌中FOXO3 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了TCGA中的32種腫瘤，共計(jì)10 897個(gè)樣本。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中分析的免疫細(xì)胞包括B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。

1.4 String數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用String數(shù)據(jù)庫(kù)探索蛋白間相互作用。String數(shù)據(jù)庫(kù)是由已知蛋白質(zhì)和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括直接的相互作用和間接的相互作用。本研究通過(guò)使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)分析FOXO3 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“FOXO3”，物種類(lèi)型選擇“Homo sapiens”，置信度選擇“Medium 0.400”，相互作用最大數(shù)選擇10。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)繪制生存曲線(xiàn)，兩組比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)基因分析工具中的Correlation 模塊，利用 Pearson、Spearman 和 Kendall 方法對(duì)給定的TCGA和GTEx表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)基因表達(dá)相關(guān)分析。通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Gene 模塊分析FOXO3基因與免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 FOXO3基因在膀胱癌中的表達(dá)

通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了FOXO3 在膀胱癌中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO3 mRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯低于正常膀胱組織(P＜0.01，圖1)。

2.2 FOXO3基因在膀胱癌中的預(yù)后分析

通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了FOXO3與膀胱癌患者的預(yù)后關(guān)系，結(jié)果顯示FOXO3 高表達(dá)組患者總生存率(OS)和無(wú)疾病生存率(DFS)較FOXO3低表達(dá)組顯著降低(OS：HR=1.4，P＜0.05；DFS：HR=1.5，P＜0.05)，見(jiàn)圖2，表明FOXO3 高表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后不良相關(guān)。

2.3 FOXO3在膀胱癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

圖1 FOXO3 mRNA在膀胱癌中的表達(dá)

通過(guò)UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析FOXO3 mRNA 表達(dá)水平與膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果表明FOXO3在膀胱癌無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1，N2，N3)的表達(dá)均顯著低于正常膀胱組織(P＜0.01)，見(jiàn)圖3。而 FOXO3 在 N0 與 N1、N2、N3 之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明FOXO3在膀胱癌中的表達(dá)水平與腫瘤是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

2.4 FOXO3在膀胱癌中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到FOXO3 表達(dá)與膀胱癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性結(jié)果，表明FOXO3基因表達(dá)與細(xì)胞純度無(wú)明顯相關(guān)性，與B 細(xì)胞(r=0.133，P＜0.05)、CD8+T細(xì)胞(r=0.262，P＜0.01)、CD4+T細(xì)胞(r=0.12，P＜0.05)、巨噬細(xì)胞(macrophages)(r=0.252，P＜0.01)、中性粒細(xì)胞(neutrophils)(r=0.242，P＜0.01)、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)(r=0.162，P＜0.01)的免疫浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān)(圖4)。這提示FOXO3 有可能參與膀胱癌細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)過(guò)程。

圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析FOXO3對(duì)膀胱癌患者總生存率和無(wú)疾病生存率的影響

圖3 FOXO3在膀胱癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

同時(shí)我們收集了常見(jiàn)的40 多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因，通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)的單基因分析工具中Correlation 模塊分析了FOXO3基因表達(dá)與膀胱癌中免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FOXO3基因與NRP1(r=0.16，P＜0.01)、 CD200R1(r=0.17，P＜0.01)、 CD276(r=0.096，P＜0.05)、CD1604(r=0.17，P＜0.05)4 個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平有顯著的正相關(guān)性(圖5)。

2.5 FOXO3基因的表達(dá)與DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因突變的關(guān)系

我們通過(guò)Sangerbox 單基因數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，利用TCGA 的表達(dá)譜數(shù)據(jù)評(píng)估了5 個(gè)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(mismatch repairs，MMRs)基因：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM突變與FOXO3基因表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示：在包括膀胱癌在內(nèi)的多數(shù)腫瘤中，F(xiàn)OXO3基因表達(dá)與MMRs基因的突變均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01)，圖6。

圖4 FOXO3表達(dá)與膀胱癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

圖6 FOXO3表達(dá)與DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因表達(dá)的相關(guān)性

2.6 FOXO3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

String數(shù)據(jù)庫(kù)中使用PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到具有11個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)的FOXO3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖7)，其中與FOXO3相 互 作 用 的 蛋 白 (score＞0.900)包 括 AKT1、 SIRT1、EP300、 BCL2L11、 SOD2、 SGK1、 AKT2、 CREBBP、CDKN1B、SMAD4，大多數(shù)均參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬和細(xì)胞代謝等生理功能。

3 討 論

圖7 FOXO3蛋白相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

膀胱癌具有較高的發(fā)病率和病死率，早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療和預(yù)后預(yù)測(cè)可以顯著改善患者的生命質(zhì)量。目前對(duì)膀胱癌的手術(shù)、放化療等綜合治療已獲得相當(dāng)?shù)寞熜?，但存在手術(shù)治療復(fù)發(fā)率高、放療和化療不良反應(yīng)較大、放化療耐藥和轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等問(wèn)題，因此急需開(kāi)展新的研究，發(fā)現(xiàn)有效的診斷標(biāo)志物和診斷方法。

FOX轉(zhuǎn)錄因子家族通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的特異性激活參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、能量代謝及腫瘤發(fā)生[3]。在FOXO 亞家族中研究最多的是FOXO3，研究發(fā)現(xiàn)FOXO3的表達(dá)水平與多種腫瘤密切相關(guān)。與正常和良性腫瘤組織相比，高級(jí)別前列腺癌中FOXO3的表達(dá)和活性均受到抑制[11]；AN等[12]發(fā)現(xiàn)SIRT1-AMPK/FOXO3信號(hào)通路在逆轉(zhuǎn)胃癌的化學(xué)抗性和腫瘤干細(xì)胞特性方面具有重要作用；LIU 等[13]發(fā)現(xiàn)FOXO3 可以通過(guò)抑制Nrf2/TR1 信號(hào)通路和增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平來(lái)逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性；同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)FOXO3高表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展有關(guān)，且其預(yù)后較差[14]。

FOXO3與膀胱癌的相關(guān)研究日益受到關(guān)注。本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)FOXO3在膀胱癌組織的表達(dá)低于正常組織，這與相關(guān)文獻(xiàn)[15]通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)得到的“FOXO3在膀胱癌組織中的表達(dá)低于其癌旁組織”結(jié)論是相符的。另外還有研究報(bào)道腫瘤抑制基因Nkx2.8通過(guò)上調(diào)FOXO3 的表達(dá)能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[16]；Polyphyllin I 可通過(guò)激活FOXO3 信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制膀胱腫瘤生長(zhǎng)[17]。以上研究表明，F(xiàn)OXO3 信號(hào)途徑與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)OXO3在膀胱癌組織中低表達(dá)使其有望作為膀胱癌的診斷標(biāo)志物。我們進(jìn)一步利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者中FOXO3高表達(dá)組患者總生存率和無(wú)疾病生存率較FOXO3低表達(dá)組顯著降低，提示其表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)FOXO3在膀胱癌無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1，N2，N3)之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明FOXO3在膀胱癌患者中的低表達(dá)與腫瘤是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒(méi)有特定的關(guān)系。

腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[18]。本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)FOXO3基因表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平均有顯著的正相關(guān)性，表明FOXO3有可能參與膀胱癌細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)過(guò)程。有文獻(xiàn)[19]報(bào)道FOXO1能促進(jìn)B細(xì)胞的分化、增殖、存活，但FOXO3 對(duì)B 細(xì)胞的作用不大，這與數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果不一致，所以非常有必要深入研究FOXO3與這些免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系。進(jìn)一步在GEPIA平臺(tái)分析發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中FOXO3基因與NRP1、CD200R1、CD276、CD160這 4 個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平有顯著正相關(guān)性。因此關(guān)注FOXO3表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的關(guān)系可以為膀胱癌免疫治療提供新的方向。此外，MMRs 為細(xì)胞內(nèi)的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制，該機(jī)制的關(guān)鍵基因功能喪失會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制錯(cuò)誤無(wú)法被修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致較高的體細(xì)胞突變的產(chǎn)生[20]。我們利用TCGA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)FOXO3 表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞中5 個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM)突變有顯著正相關(guān)性。這也為FOXO3在膀胱癌的研究提供了新思路。

FOXO3 信號(hào)途徑參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。我們使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與FOXO3 相互作用的蛋白，這些蛋白主要有AKT1、SIRT1、EP300、BCL2L11、SOD2、SGK1、AKT2、CREBBP、CDKN1B、SMAD4。其中，AKT 可抑制FOXO3 的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致FOXO3向核外轉(zhuǎn)移并被泛素-蛋白酶體途徑降解，從而抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡[21]，表明靶向AKT 信號(hào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在膀胱癌中，microRNA-608可以通過(guò)激活A(yù)KT/FOXO3 信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1 期來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖[22]。此外，SIRT1 低表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)，SIRT1 通過(guò)激活A(yù)MPK/FOXO3 信號(hào)途徑抑制腫瘤細(xì)胞化療耐藥[12]；在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EP300能夠上調(diào)FOXO3的活性，從而增加細(xì)胞對(duì)拉帕替尼的敏感性[23]；在前列腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)OXO3位點(diǎn)的磷酸化可以抑制SGK1 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡[24]。FOXO3與部分蛋白分子的關(guān)系是在非腫瘤模型中進(jìn)行的，如在哺乳動(dòng)物卵巢中，F(xiàn)OXO3通過(guò)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡來(lái)調(diào)節(jié)卵泡閉鎖和卵泡生長(zhǎng)，F(xiàn)OXO3表達(dá)下調(diào)會(huì)降低促凋亡因子BCL2L11 的mRNA 水平[25]；在骨性關(guān)節(jié)炎模型中，F(xiàn)OXO3 過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)SOD2 和過(guò)氧化氫酶的表達(dá)，從而抑制軟骨損傷的發(fā)展[26]；FOXO3還可通過(guò)激活CDKN1B(p27kip1)的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)成年大鼠脊髓損傷后的再生[27]。膀胱癌中FOXO3與這些蛋白分子之間的相互作用鮮有報(bào)道，它們的具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，發(fā)現(xiàn)FOXO3在膀胱癌組織中呈低表達(dá)，腫瘤患者中高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)；FOXO3有可能參與膀胱癌細(xì)胞免疫浸潤(rùn)過(guò)程，并與部分免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平有顯著正相關(guān)性；FOXO3表達(dá)與DNA錯(cuò)配修復(fù)基因的突變關(guān)系密切；FOXO3通過(guò)與其他蛋白的相互作用參與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和代謝等過(guò)程。這些表明FOXO3有望成為膀胱癌的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。FOXO3作為一個(gè)潛在的抑癌基因，有必要深入研究該基因在膀胱癌中的作用機(jī)制和功能，以期為FOXO3在膀胱癌中的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。