邵俊國，焦文靜，王雪曉，張金艷，馬 鳴，

(1．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗科，河北石家莊 050011；2．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤免疫科，河北 石家莊 050011)

肺癌(lung carcinoma，LC)是我國乃至世界范圍內(nèi)最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)世界癌癥統(tǒng)計報告，2015 年我國有超過73 萬新發(fā)病例，死亡病例超過60萬，其病理類型主要分為非小細(xì)胞癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)和小細(xì)胞癌(small-cell lung carcinoma，SCLC)兩大類，其中NSCLC 約占所有患者的85%[1]。由于肺癌進(jìn)展較快，大部分患者就診時已處于中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，腫瘤的耐藥、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者治療失敗與死亡的重要原因，尋找與臨床療效及預(yù)后密切相關(guān)的有效預(yù)測靶點(diǎn)是目前科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。

微RNA(microRNAs，miRNA)在各種腫瘤中的表達(dá)及其功能研究受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注，其極有可能成為腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)和標(biāo)志物。miR-429 屬miR-200 家族成員，是具有廣泛抗腫瘤活性的microRNA，它在肝癌、結(jié)腸癌及胃癌等多種惡性腫瘤中可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤多藥耐藥性的發(fā)生，影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展[2]。B 細(xì)胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點(diǎn)-1(B-cellspecific Moloney murine leukemia virus integration site-1，Bmi-1)是一類重要的轉(zhuǎn)錄抑制基因，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞放、化療抵抗方面具有重要作用，多種腫瘤組織中Bmi-1的表達(dá)水平均呈明顯升高的狀態(tài)，過表達(dá)的Bmi-1可通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)和增加腫瘤細(xì)胞表達(dá)MDR相關(guān)蛋白等機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對放射線和化療藥物的抵抗作用[2-3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，食管癌腫瘤組織中高表達(dá)miR-429 和低表達(dá)Bmi-1 蛋白的患者往往瘤組織較小、患者臨床分期較早，同時患者5 年生存率較高，提示檢測瘤組織中miR-429 及Bmi-1 蛋白的表達(dá)水平可作為標(biāo)志物在監(jiān)測食管癌患者臨床進(jìn)展及預(yù)后方面具有重要作用。這使我們聯(lián)想到，在肺癌組織中，miR-429 及Bmi-1 mRNA 檢測是否具有同樣的意義？基于此，本課題分析了60例肺癌患者瘤組織中miR-429及Bmi-1 mRNA的表達(dá)水平及其與患者臨床進(jìn)展和預(yù)后之間的關(guān)系，為其作為標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌臨床進(jìn)展及治療監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 LC組織的收集及患者資料

60 例肺癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5cm，經(jīng)病理證實(shí)不含癌組織)，取自2013年1—12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院就診的LC 患者，其中，男性34 例，女性26例，中位年齡為65歲(40～86歲)，其中11例患者病理類型為SCLC，49 例患者為NSCLC；所有患者均按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)(第7版)進(jìn)行臨床TNM分期，所有患者均經(jīng)病理檢測確診且術(shù)前均未接受放、化療，并簽署知情同意書。本研究已經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。所有患者術(shù)中組織標(biāo)本均快速凍存于-80 ℃低溫冰箱。

1.2 實(shí)驗試劑

實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑盒，購自美國Thermo 公司；Trizol 試劑及RNA 提取試劑盒均購自Solarbio 公司；miR-429 及Bmi-1引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR 法檢測患者瘤組織中miR-429及Bmi-1 mRNA表達(dá)水平

取患者LC 組織或癌旁組織，常規(guī)兩步法提取細(xì)胞總RNA，miR-429 及Bmi-1 擴(kuò)增引物序列由上海生工設(shè)計，序列如下：miR-429，上游5′-GCGAGGGT AATACTGTCTGGT-3′，下游 5′-CACTTCCTCAGCAC TTGTTCGTAT-3′；U6，上游 5′-GCTTCGGCAGCACA TATACTAAAAT-3′，下游 5′-CGCTTCACGAATTTGC GTGTCAT-3′；Bmi-1，上游 5′-AAATGCTGGAGAAC TGGAAAG-3′，下游 5′-AACTGTGGATGAGGAGACT G-3′。參考試劑盒說明書進(jìn)行qPCR 分析。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、5 min；95 ℃、15 s、60 ℃、30 s、72 ℃、30 s，共40個循環(huán)。miR-429及Bmi-1 mRNA的表達(dá)水平以 2-ΔΔCT值表示，其具體計算方式參考文獻(xiàn)[4]。

1.4 LC患者瘤組織中miR-429及Bmi-1 mRNA表達(dá)水平與患者臨床特征、病情進(jìn)展及預(yù)后之間的關(guān)系分析

根據(jù)方法 2.1 中LC 組織中 miR-429 及 Bmi-1 mRNA 的表達(dá)水平，計算 60 例患者 2-ΔΔCT值的均值，LC 組織中miRNA-429 及Bmi-1 的表達(dá)水平分為高表達(dá)組(≥均值水平)和低表達(dá)組(＜均值水平)，分析miR-429 或Bmi-1 高表達(dá)組與低表達(dá)組患者年齡、性別、瘤組織大小、患者臨床分期、病理類型、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者總生存期(overall survival time，OS)之間的差異。OS定義為手術(shù)開始至患者死亡或隨訪截止的時間，隨訪截止時間為2018年6月。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗結(jié)果以xˉ±s表示，所有實(shí)驗均獨(dú)立重復(fù)3次，分析LC組織與相應(yīng)的癌旁組織中miR-429表達(dá)差異采用配對t檢驗，miR-429 表達(dá)與LC 患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系采用χ2檢驗，miR-429 與Bmi-1 表達(dá)間的關(guān)系采用Spearman 秩相關(guān)性檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，患者生存率比較采用logrank 法，影響患者預(yù)后的多因素分析采用Cox 回歸分析，兩獨(dú)立樣本間的比較采用t檢驗。以α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-429 及 Bmi-1 在 ESCC 組織中的表達(dá)水平及其與患者臨床病理指標(biāo)及患者生存期之間的關(guān)系

采用qPCR檢測LC組織及對應(yīng)的癌旁組織中miR-429 及Bmi-1 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1 所示，可見NSCLC 及SCLC 組織中miR-429 表達(dá)水平均較癌旁組織明顯減低，而Bmi-1 mRNA表達(dá)水平則均較癌旁組織明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；但NSCLC 與 SCLC 組織中 miR-429 及 Bmi-1 mRNA 表達(dá)水平均無明顯差異(P＞0.05)。Spearman 秩相關(guān)性檢驗分析結(jié)果顯示，LC組織中miR-429和Bmi-1的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.463 2，P＜0.01)。

圖1 miR-429及Bmi-1在LC組織中的表達(dá)水平及二者相關(guān)性分析

2.2 LC 組織中 miRNA-429 與 Bmi-1 表達(dá)水平與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

以上述60 例LC 患者腫瘤組織中miR-429 的平均相對表達(dá)水平0.51 為臨界閾值，將60 例LC 患者分為miR-429 高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中miR-429 高表達(dá)者29例，低表達(dá)者31例。同時，以Bmi-1的平均相對表達(dá)水平1.53 為臨界閾值，將LC 患者瘤組織分為Bmi-1高表達(dá)和低表達(dá)組。χ2檢驗分析結(jié)果見表1及表2，LC 組織中高表達(dá)與低表達(dá)miR-429 及Bmi-1 的患者性別、年齡及病理類型均無明顯差異(P＞0.05)，而患者瘤組織大小、臨床分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯差異(P＜0.05)。LC 組織中 miR-429 呈低表達(dá)而Bmi-1 呈高表達(dá)的患者往往瘤組織較大、臨床分期較晚、更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表1 LC組織中miR-429表達(dá)水平與LC患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

2.3 LC 組織中 miRNA-429 與 Bmi-1 表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響

Log-rank分析結(jié)果見圖2，顯示瘤組織中miR-429低表達(dá)的患者，5年生存率為13.79%，明顯低于miR-429高表達(dá)的患者(41.93%，P＜0.01)。同時，瘤組織中Bmi-1 高表達(dá)的患者，5 年生存率為15.63%，明顯低于Bmi-1低表達(dá)的患者(42.86%，P＜0.05)。

表2 LC組織中Bmi-1 mRNA 表達(dá)水平與LC患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

2.4 影響LC患者預(yù)后因素分析

單因素分析結(jié)果見表3，LC 患者臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-429 及Bmi-1 的表達(dá)水平均與患者OS 有關(guān)(P＜0.05)，而本組中患者性別、年齡、瘤組織大小及病理類型均與5 年生存率無顯著相關(guān)(P＞0.05)。Cox 回歸多因素結(jié)果見表4，LC 患者臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-429及Bmi-1的表達(dá)水平是影響LC患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P＜0.05)。

3 討 論

圖2 miR-429及Bmi-1表達(dá)水平與LC患者預(yù)后之間的差異分析

表3 影響LC患者預(yù)后的單因素分析

表4 影響LC患者預(yù)后的多因素分析

MiR-429 屬miR-200 家族成員，近年來，關(guān)于其調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長的作用受到廣泛關(guān)注[6-7]。Bmi-1 是一類重要的轉(zhuǎn)錄抑制基因，其可通過結(jié)合于靶基因的啟動子區(qū)，抑制靶基因的表達(dá)，在促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的增殖及自我更新中具有重要作用[8-9]。同時，近年來我們的研究結(jié)果及文獻(xiàn)[10-12]報道均顯示，Bmi-1在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞放、化療抵抗方面具有重要作用，多種腫瘤組織中Bmi-1的表達(dá)水平均呈明顯增高的狀態(tài)，過表達(dá)的Bmi-1可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對放射線和化療藥物的抵抗作用，促進(jìn)患者病情進(jìn)展，進(jìn)而影響患者臨床療效和預(yù)后。

但miR-429及Bmi-1在LC組織中的表達(dá)及其臨床意義目前研究仍較少?；诖耍覀兺ㄟ^qPCR 技術(shù)檢測了60 例LC 患者腫瘤組織中miR-429 及Bmi-1 mRNA 的表達(dá)水平，并分析了二者與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LC組織中miR-429表達(dá)水平較癌旁組織明顯降低，而Bmi-1表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高。LC組織中miR-429低表達(dá)而Bmi-1高表達(dá)的患者往往瘤組織較大、臨床分期較晚、更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時患者5 年生存率較低。這提示，組織中低表達(dá)miR-429 和高表達(dá)Bmi-1 可能是肺癌臨床進(jìn)展和預(yù)后較差的預(yù)測性指標(biāo)。這與我們前期在食管癌及彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)組織中的研究結(jié)果是一致的[4，13]，提示miR-429 及Bmi-1 作為腫瘤標(biāo)志物，其臨床意義在不同腫瘤中可能具有一定普遍性。Cox回歸多因素分析結(jié)果也顯示，LC 患者臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-429及Bmi-1的表達(dá)水平是影響LC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。這與我們前期研究及文獻(xiàn)[4，7]報道，miR-429 及Bmi-1 的表達(dá)可影響多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及放化療敏感性的結(jié)論是一致的，瘤組織中miR-429及Bmi-1的聯(lián)合檢測在LC中，具有預(yù)測患者臨床進(jìn)展和預(yù)后的作用。

我們也發(fā)現(xiàn)，LC組織中miR-429和Bmi-1 mRNA的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，提示在LC 中miR-429 與Bmi-1 的表達(dá)可能呈一定的負(fù)調(diào)控作用。與靶基因3′端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)相互結(jié)合，降解靶基因mRNA 或抑制靶基因mRNA 的表達(dá)，是microRNAs 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的主要機(jī)制[14]。我們在前期研究中，通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmi-1 可能是miR-429 下游作用的靶基因。雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果也顯示，共轉(zhuǎn)染miR-429 和Bmi-1 熒光質(zhì)粒的293T 細(xì)胞，其熒光素酶活性明顯下降，這進(jìn)一步驗證了我們的假設(shè)[4]。同時，鑒于Bmi-1在多種腫瘤細(xì)胞中影響DNA損傷修復(fù)過程及腫瘤耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)等方面的重要作用，我們的結(jié)果也提示miR-429/Bmi-1 軸可能在調(diào)控肺癌細(xì)胞放化療敏感性方面具有重要作用，組織中miR-429 和Bmi-1 表達(dá)水平的聯(lián)合檢測具有成為肺癌臨床療效及預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)的潛力，因此，二者具有成為肺癌腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于臨床的潛力。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)瘤組織中miR-429 及Bmi-1的表達(dá)水平與LC 患者臨床進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，二者聯(lián)合檢測對于LC 臨床療效監(jiān)測具有一定意義，因此，在未來LC臨床綜合診療中具有廣泛的應(yīng)用前景。