蔡 穎，李閏冰 ，鄭 凱，秦雙建 ，李柏茹 ，張朝暉，徐新云

(1．深圳市疾病預防控制中心，廣東 深圳518055；2．南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽 421001；3．中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院，湖南 長沙 410078)

隨著中國城市化進程快速發(fā)展，霧霾作為一種災害性天氣現象，已經成為影響大眾健康的公共衛(wèi)生問題。大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是霧霾的主要成分之一，PM2.5憑借粒徑小和表面積大等優(yōu)勢，能較長時間懸浮在空氣中，并能隨著呼吸道進入肺泡，誘發(fā)許多呼吸系統疾病[1]。多項研究發(fā)現，哮喘發(fā)生率的增加與大氣中PM2.5的濃度上升有很大關系[2-3]。呼吸系統是PM2.5暴露和發(fā)揮作用的主要靶器官，我國工業(yè)化發(fā)展的同時也伴隨著PM2.5濃度的不斷上升，對人類健康構成了重大威脅，因此，探索PM2.5對呼吸系統損害的分子機制對于呼吸系統疾病的預防和治療具有重要意義[4-6]。

近年來，研究發(fā)現非編碼RNA在生物發(fā)育過程中起著重要的基因調控作用，microRNA(miRNA)一直是非編碼RNA中的研究熱點，可以在轉錄水平及轉錄后水平調控基因表達。許多研究表明，miRNA表達失調在PM2.5誘導呼吸系統疾病中起著重要作用，包括哮喘[7]，肺癌[8]等。miRNA 還被證明與免疫系統調節(jié)有關[9]。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤進展中的一個關鍵形態(tài)學變化，研究報道了A549 細胞暴露于PM2.5后誘發(fā)EMT，當敲除miR-32后顯著增強Smad1介導的信號通路活性，增強了細胞的遷移和侵襲能力，促進EMT 進程[10]。由此可見，miRNA在PM2.5介導機體發(fā)生損傷的過程中起著重要的調控作用。因此，本文選取HBE 細胞作為實驗對象，分析PM2.5暴露后是否引起HBE 細胞中的miRNA 表達改變，以及利用生物信息學方法篩選差異miRNAs，并進行功能富集分析，篩選關鍵miRNAs 及靶基因，從而在非編碼RNA 研究領域為PM2.5致HBE 細胞損傷的分子機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HBE細胞購于中國上海細胞庫，PM2.5樣品來源于山西省太原市，DMEM 培養(yǎng)基購于Hyclone 公司。胎牛血清(FBS)、0.25% Trpsin-EDTA 購于美國Gibco公司。

1.2 PM2.5采集與處理

使用TH-150CⅢ型中流量大氣采樣器(武漢市天虹儀器有限責任公司)采集PM2.5樣品，采樣地點選擇煤炭消耗大省山西太原市，采樣流速100 L/min，每次采樣時間24 h。將吸附有PM2.5的濾膜剪成2 cm×2 cm放于燒杯中，加入超純水完全浸沒濾膜，用一層錫箔紙使燒杯口密封，超聲振蕩30 min，去除燒杯中殘留的濾膜，制成PM2.5懸濁液，于-80 ℃條件下冷凍24 h。然后將樣品置于真空冷凍干燥機中干燥24 h，至PM2.5完全干燥后用紫外燈滅菌1～2 h，用超純水溶解PM2.5顆粒后制成PM2.5儲備液，分裝后于-20 ℃保存待用，使用前振蕩混勻。

1.3 細胞培養(yǎng)與PM2.5染毒

將HBE細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、CO2體積分數為5%的溫箱中傳代培養(yǎng)。待細胞生長至對數期時，以未處理組作為對照組，根據前期實驗研究，PM2.5染毒HBE 細胞的IC50為70.12 mg/mL，因此采用50 mg/mL 的PM2.5染毒濃度作為實驗組(以下稱PM2.5組)，于不含胎牛血清及雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基中進行PM2.5染毒培養(yǎng)，每組一式3份準備miRNA測序。

1.4 構建cDNA文庫及miRNA測序

高通量測序(illumina HiSeqTM2500/MiSeq 測序平臺)檢測RNA 樣品中miRNA 的表達情況，由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成。大致流程為：①RNA樣品檢測。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染；Nanodrop 檢測RNA 的純度[D(260)/D(280)比 值]； Qubit 對 RNA 濃 度 進 行 精 確 定 量 ；Agilent 2100 精確檢測RNA 的完整性。②使用Small RNA Sample Pre Kit 構建文庫。③使用Qubit2.0 進行初步定量后，采用qPCR 方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度＞2 nmol/L)，以保證文庫質量。④把不同濃度文庫按照不同比例混合后進行HiSeq/MiSeq測序。

1.5 miRNA差異表達分析

使用熱圖進行層次聚類分析以顯示樣品之間差異miRNA表達量的聚類模式。

用火山圖可以推斷差異表達miRNA的整體分布情況，從差異倍數(fold change)和校正后的P值兩個水平進行評估，按照調整后P＜0.05 的標準篩選差異表達miRNAs。

1.6 miRNA功能預測

由miRanda和RNAhybrid兩個軟件預測miRNAs的靶基因，對每組差異表達miRNAs 的靶基因的集合進行富集分析。Gene Ontology(http://www.geneontology.org/)是基因功能國際標準分類體系，從生物學過程、細胞組分和分子功能3 個方面對靶基因進行功能注釋，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關信號通路的主要公共數據庫，能確定候選靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

1.7 相互作用網絡圖

miRNAs 與靶基因及靶基因之間的相互作用關系構建網絡圖為：①采用Cytoscape 軟件對miRNAs 及其相應的靶基因間的相互作用關系繪制成可視化網絡圖。篩選與靶基因相互作用數量較多的miRNAs 作為核心miRNAs。②利用STRING在線數據庫預測靶基因間的相互作用關系，再由Cytoscape繪制成網絡圖。篩選其中相互作用數量超過10個節(jié)點的靶基因作為核心靶基因。

2 結 果

2.1 PM2.5暴露導致HBE細胞內miRNAs表達譜改變

PM2.5組和對照組HBE 細胞miRNA 高通量測序結果見圖1。兩組分別檢測到1 021和927個miRNA，兩組取交集得811 個miRNAs。根據調整后P＜0.05 篩選標準，有27 個miRNAs 發(fā)生差異表達，其中7 個miRNAs 表達上調，20 個miRNAs 表達下調。miR-372-3p 上調倍數最大，FC 為 1.94；miR-223-3p 下調程度最大，FC 為0.11。火山圖和熱圖展示了27 個差異miRNAs的分布情況，見圖2。差異倍數較大的前15個miRNAs見表1。

圖1 PM2.5染毒組和對照組HBE細胞中miRNA測序結果

圖2 miRNAs表達譜分布圖

2.2 miRNAs功能富集分析

應用GO和KEGG 富集分析來預測差異miRNAs 的功能，結果見圖3 和圖4。GO 分析結果顯示，差異miRNAs 主要參與細胞代謝、蛋白質代謝等生物學過程，如單一生物代謝過程、代謝過程等。細胞組分主要集中在胞內如細胞質、細胞器等。對于分子功能，差異miRNAs主要體現在蛋白質結合、催化活性等。

表1 前15個差異表達miRNAs

為了分析PM2.5致HBE細胞損害的潛在機制，采用KEGG 數據庫對靶基因參與調控的信號通路及途徑進行分析。結果顯示，代謝途徑、PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路等途徑可能是PM2.5發(fā)揮毒性作用的潛在途徑。

2.3 相互作用關系分析

圖3 候選靶基因GO富集柱狀圖

圖4 候選靶基因KEGG富集散點圖

圖5 miRNA-靶基因網絡圖

2.3.1 miRNAs-靶基因相互作用對miRNAs 進行功能預測得到miRNA參與調控的生物學過程及相關信號通路，再利用可視化軟件展現miRNAs 及其靶基因間的對應關系，見圖5。一個miRNA 可以調控多個靶基因，一個靶基因也可以由多個miRNA調控。將與靶基因相互作用數量較多的miRNA(上調5個，上調6個)作為核心miRNAs，繪制核心miRNAs-靶基因相互作用網絡圖。結果顯示，上調核心miRNAs為：miR-371b-3p、miR-371a-5p、miR-27a-3p、miR-7-5p、miR-372-3p，其中miR-371b-3p調控靶基因最多。下調核心 miRNAs 為 miR-145-5p、miR-133a-3p、miR-204-5p、miR-125b-5p、miR-486-5p、miR-512-3p，其中miR-145-5p調控靶基因最多。

2.3.2 靶基因相互作用將上調和下調差異miRNA的靶基因分別輸入STRING 在線數據庫，利用Cytoscape 可視化軟件對所得TSV 文件數據繪制網絡圖，見圖6。并篩選由下調miRNAs 調控的3個相互作用節(jié)點大于10 的核心基因，為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、絲裂原激活的蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)和 CC 趨化因子受體 5 型(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)。

3 討 論

圖6 靶基因相互作用網絡圖

在過去的幾十年里，miRNAs 已經越來越為人們所廣泛研究[11-12]。miRNA 是一種高度保守的小型非編碼RNA。通過與靶mRNA 的3′非編碼區(qū)堿基互補配對，在轉錄后水平調控基因表達，發(fā)揮其生物學功能。miRNAs 能通過抑制翻譯或者降解靶基因來維持細胞代謝、細胞凋亡、蛋白質合成等正常生理過程[13]，在異常表達情況下，miRNA 既能充當致癌基因也能作為抑癌基因[14-15]。有許多研究發(fā)現，PM2.5暴露能導致miRNAs 表達譜的改變[16]，為呼吸系統疾病的分子機制研究提供了新的方向。

利用Illumina 測序平臺，快速、高效地讀取高質量的測序數據。我們在PM2.5組和對照組分別檢測到1 021 和 927 個 miRNA。按照調整后P＜0.05 篩選條件，我們共篩選到27 個差異miRNAs，包括7 個上調miRNAs和20個下調miRNAs。對靶基因進行富集分析顯示，差異miRNAs 主要參與代謝途徑、PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路等關鍵信號轉導途徑。PI3K-AKT 信號通路是細胞內重要信號轉導通路，廣泛參與了細胞增殖、代謝及死亡等生命過程，在腫瘤發(fā)展進程中起著重要的調控作用[17]。膠質瘤細胞中MRPS16(線粒體核糖體蛋白S16)過表達通過激活PI3K-AKT 信號通路促進Snail 的表達，從而促進腫瘤的進展[18]。MAPK 信號途徑是涉及細胞增殖、分化及凋亡等生物學過程的關鍵途徑，已有許多證據表明了MAPK 信號途徑失控與多種惡性腫瘤包括肺癌的發(fā)展、診斷及預后的相關性[19]。Soleimani 等[20]發(fā)現Ras/MAPK 信號通路中的miRNAs 在大腸癌細胞增殖、凋亡等過程中起著重要作用。

我們分別對上下調表達差異miRNAs 及其預測的靶基因構建相互作用網絡圖，結果顯示，共鑒定11個核心miRNAs，含上調5 個：miR-371b-3p、miR-371a-5p、miR-27a-3p、miR-7-5p、miR-372-3p，其中miR-371b-3p 調控靶基因最多。下調6 個：miR-145-5p、 miR-133a-3p、 miR-204-5p、 miR-125b-5p、miR-486-5p、miR-512-3p，其中miR-145-5p 調控靶基因最多。Yue等[21]研究發(fā)現，miR-371a-5p過表達后能逆轉腫瘤抑制因子lncRNA TUSC7 對胰腺癌細胞遷移、侵襲和EMT的抑制作用。有研究表明，miR-27a-3p 既具備腫瘤抑制作用[22]也可促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[23]。miR-145-5p 是一種腫瘤抑制因子miRNA，在肺癌[24]、膠質母細胞瘤[25]等癌癥中表達下調。miR-7-5p[26]、372-3p[27]、miR-133a-3p[28]、miR-204-5p[29]等也被證明在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。關于這些核心miRNAs 在PM2.5致HBE 細胞損傷中的分子機制尚不完全清楚，有待后續(xù)研究。

進一步對靶基因之間相互作用分析發(fā)現，VEGFA、MAPK3、CCR5位于核心位置。VEGFA在血管生成、細胞增殖及遷移等途徑發(fā)揮重要作用，該基因被證明在許多癌癥中表達上調[30]。MAPK3是哺乳動物中第一個被發(fā)現的絲裂原活化蛋白激酶，是ERK/MAPK 信號途徑中重要組成部分。Cao 等[31]證明miR-129靶向MAPK3調控胃癌細胞增殖，當MAPK3基因表達抑制時能誘導胃癌細胞凋亡，降低順鉑耐藥性。趨化因子受體是一類介導趨化因子行使功能的GTP-蛋白偶聯的跨膜受體，已有許多研究表明CCR5 在激活癌癥的生長及轉移中具有重要作用[32]。本實驗中這3個蛋白與下調的miRNAs 靶向相關，提示VEGFA、MAPK3、CCR5 在PM2.5染毒HBE 后有可能受到調控而發(fā)生表達改變，可以為下一步PM2.5的致病機制研究提供參考。

綜上所述，本文采用miRNA測序技術測定了PM2.5染毒HBE 細胞后的差異miRNAs，主要富集在PI3KAkt 信號通路、腫瘤相關途徑、Ras 信號通路、MAPK信號通路等，篩選了11 個核心miRNAs 和3 個核心基因，并且這些miRNAs 和蛋白與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系，為進一步深入研究PM2.5毒性作用機制拓展了新思路。