王 平 ，姜 曉，韓 飛，崔志鴻，唐 瑩，4，周洋西 ，，劉文斌，曹 佳，劉晉祎，

(1．陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系毒理學(xué)研究所，重慶 400038；2．陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液病醫(yī)學(xué)中心，重慶 400037；3．西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；4．寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，寧夏 銀川 750004)

半個(gè)多世紀(jì)以來，人類的平均壽命已得到顯著提高，但同時(shí)人類的生殖健康水平卻趨于下降。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從1973 到2011 年，全球男性精子總數(shù)和密度每年分別降低約5.33×106個(gè)和0.7×106/mL[1-2]，臨床上各種男性生殖疾病(如隱睪癥、睪丸癌、精子計(jì)數(shù)低等)的發(fā)病率也在逐漸增加[3-4]。研究表明，基因與環(huán)境交互作用是造成男性生殖功能損傷尤其是生精障礙的重要原因，但總體上來說相關(guān)的發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)未闡明[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子SOX30可能在生精過程中具有重要作用。在成體小鼠各個(gè)器官中，SOX30基因除了在睪丸高水平表達(dá)，在附睪和肺低水平表達(dá)外，其他臟器均幾乎無表達(dá)[6]。而且SOX30在各組織中的表達(dá)明顯受到DNA 甲基化的調(diào)控，在SOX30表達(dá)的成年小鼠睪丸中，SOX30呈低甲基化狀態(tài)[6-7]。此外，SOX30還與臨床非阻塞性精子缺乏疾病(non-obstructive azoospermia，NOA)關(guān)系密切[8]。最近，國內(nèi)外也有其他研究證實(shí)SOX30基因與睪丸發(fā)育密切相關(guān)，在精子發(fā)生中起關(guān)鍵作用[9-11]，但是SOX30基因在雄性生殖系統(tǒng)中是否有其他的功能和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建了SOX30基因敲除小鼠模型，探討SOX30基因在雄性生殖系統(tǒng)中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DNA 提取試劑盒購自康威世紀(jì)公司；4%福爾馬林溶液、驢抗小鼠IgG(H+L)-熒光Alexa Fluor 555 和山羊抗小鼠IgG(H+L)-Alexa Fluor 488 二抗、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司；睪酮(testosterone，T)和抑制素B(inhibin B，INH-B)檢測盒(ELISA 法)購于武漢云克隆科技公司；SOX9 抗體和3β-HSD抗體購自Santa公司。

1.2 SOX30基因敲除小鼠模型構(gòu)建

SOX30 敲除小鼠委托南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心構(gòu)建。將從BAC克隆中酶切獲取含有同源臂的靶序列和LoxP-SA-IRES-GFP-NEO-STOP-PPS-2nd LoxP 簇通過同源重組方式引入到SOX30基因外顯子1 和外顯子2 之間。通過PCR，酶消化和測序證實(shí)含有目的序列的打靶載體。用AsiSI 酶切法將打靶載體線性化，再將打靶載體經(jīng)電穿孔方式轉(zhuǎn)到C57BL/6 胚胎干細(xì)胞。通過具有的G418和更昔洛韋(Ganc)抗性進(jìn)行重組體胚胎干細(xì)胞的篩選。隨后對這些篩選的重組體細(xì)胞通過PCR 和Southern blot 方式鑒定篩選陽性胚胎干細(xì)胞。將C57BL/6小鼠與嵌合體小鼠(陽性克隆進(jìn)行顯微注射獲得嵌合體)交配產(chǎn)生雜合型(KW)小鼠。PCR法鑒定雌雄KW 小鼠雜交后代基因型，產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)用野生型(WW)、KW 和純合型(KK)小鼠。本研究獲得陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 SOX30基因敲除小鼠基因型鑒定

用手術(shù)剪剪取3 周齡小鼠尾端3～5 mm，置于含500 μL 蛋白酶 K 和 SNET 裂解混合液的 EP 管中，37 ℃消化過夜。按照DNA 提取試劑盒說明書操作方法提取鼠尾DNA，PCR后產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分帶鑒定基因類型，引物序列見表1。

1.4 SOX30 基因敲除小鼠臟器組織取材及臟器指數(shù)計(jì)算

選取 2.5 月齡 WW 型、KW 型和 KK 型雄性小鼠各5 只，稱取體質(zhì)量并記錄。小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后立即用眼科剪解剖，取出雙側(cè)睪丸和附睪、精囊和心、肝、脾、腎、肺等器官，分別拍照、稱質(zhì)量、記錄并計(jì)算臟器指數(shù)(臟器系數(shù)=實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的質(zhì)量/該動(dòng)物總質(zhì)量×100%)。一側(cè)睪丸和附睪組織置于EP 管冰凍備用(-80 ℃)，另一側(cè)睪丸和附睪置于4%福爾馬林溶液中固定。

1.5 SOX30基因敲除小鼠睪丸、附睪組織病理分析

固定好的睪丸和附睪組織樣本經(jīng)脫甲醛、正向梯度乙醇(75%、85%、95%和100%)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋處理后，切片制成4 μm 石蠟組織片。再將切片脫蠟、水化、蘇木素-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸和附睪組織切片病理結(jié)構(gòu)，記錄生精細(xì)胞及精子、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等形態(tài)特征。

1.6 曲細(xì)精管直徑統(tǒng)計(jì)分析

采用光學(xué)顯微鏡觀察各基因型小鼠睪丸組織HE染色病理切片并拍照，每個(gè)基因型小鼠選取20個(gè)圓形曲細(xì)精管，采用Image J軟件測量曲細(xì)精管直徑。

1.7 ELISA法檢測睪丸組織激素水平

取出小鼠一側(cè)睪丸組織快速低溫冰凍，置于自動(dòng)組織勻漿儀，加入PBS液1 mL，快速勻漿制成組織懸液。靜置10 min 后，4 ℃離心5 min(12 000 r/min)，取上清液于EP 管冷凍保存(-80 ℃)。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測T 和INH-B。簡要步驟如下：標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔和空白孔依次對應(yīng)加樣，加入工作A液混合溫育1 h，洗板3次后加工作液B溫育30 min、洗滌5 次加顯色劑10 min、滴加終止液后用酶標(biāo)儀測量各孔D(450)值，制作標(biāo)準(zhǔn)品濃度曲線并計(jì)算樣品濃度。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各樣本蛋白濃度，并根據(jù)蛋白濃度計(jì)算出各樣本的T和INH-B含量。

1.8 組織免疫熒光激光共聚焦檢測

將WW 組和KK 組小鼠的石蠟包埋睪丸組織切片后，4‰ Triton X-100 室溫靜置20 min，抗原修復(fù)15 min，PBS 浸泡洗滌5 min(重復(fù)3 次)，胎牛血清封閉 30 min(37 ℃)，滴加一抗(SOX9 或 3β-HSD)置于4 ℃過夜孵育，洗滌后滴加熒光二抗避光孵育1 h(37 ℃)，PBS洗滌后DAPI避光孵育10 min，PBS洗滌封片。共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 800；Germany)觀察小鼠睪丸支持細(xì)胞特異性SOX9 蛋白及間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白3β-HSD 的表達(dá)量。每個(gè)基因型小鼠隨機(jī)選取10 個(gè)視野采集免疫熒光圖片，采用Image J 軟件分析各免疫熒光圖片中陽性信號的熒光強(qiáng)度并利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析(analysis of variance ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較采用q檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 SOX30基因敲除小鼠模型基因鑒定結(jié)果

如圖1 所示，引物A 和B 為純合敲除SOX30基因型鑒定引物，引物C 為SOX30野生型鑒定引物。根據(jù)基因型鑒定引物檢測結(jié)果，1號小鼠為野生型小鼠，2號小鼠為純合缺失型小鼠，3號小鼠為雜合型小鼠。

2.2 SOX30敲除雄性小鼠一般情況和臟器系數(shù)變化

飼養(yǎng)過程中雄性SOX30敲除小鼠的毛發(fā)、精神和活動(dòng)量等生活狀態(tài)良好。WW 型、KW 型和KK 型3種基因型小鼠比較，體質(zhì)量未見明顯差異(P＞0.05)(圖2A)；3種基因型小鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺及精囊臟器系數(shù)無明顯差異(P＞0.05)(圖 2B～H)；與 WW 和KW組比較，KK組小鼠睪丸體積明顯減小，睪丸臟器系數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2I)。

2.3 SOX30敲除小鼠曲細(xì)精管直徑變化

由于睪丸體積的絕大部分由曲細(xì)精管組成，是精子形成的場所。因此，我們在發(fā)現(xiàn)SOX30敲除小鼠睪丸體積變小(圖3A)和睪丸臟器指數(shù)降低的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對不同基因型小鼠的曲細(xì)精管直徑進(jìn)行了測量和統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WW 組小鼠比較，KK 組小鼠曲細(xì)管直徑明顯縮小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖3B～D)。

2.4 SOX30敲除小鼠睪丸、附睪組織病理分析

通過對SOX30基因敲除小鼠睪丸和附睪組織進(jìn)行病理切片觀察，我們發(fā)現(xiàn)，WW 型和KW 型小鼠睪丸組織曲細(xì)精管內(nèi)各級生精細(xì)胞排列整齊，圓形精子和長形精子細(xì)胞密度適中，曲細(xì)精管間區(qū)間質(zhì)分布均勻(圖4A 和B)，附睪組織內(nèi)成熟精子密集豐富(圖4D 和E)，WW 型和KW 型小鼠睪丸和附睪組織均未見明顯病理形態(tài)學(xué)改變。與WW型和KW型不同，KK型小鼠曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞排列紊亂，可見空泡變性和多個(gè)巨細(xì)胞，未見長形精子，曲細(xì)精管外間質(zhì)增生明顯(圖4C)。KK 型小鼠附睪組織切片中精子數(shù)量很少(圖4F)。這些檢測結(jié)果提示，SOX30敲除可導(dǎo)致睪丸組織出現(xiàn)明顯的病理損傷，并導(dǎo)致精子生成障礙。

圖2 SOX30敲除對小鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響(n=5)

圖3 SOX30敲除對小鼠睪丸體積和曲細(xì)精管直徑的影響

2.5 SOX30 敲除抑制小鼠睪丸組織T 和INH-B 激素分泌

SOX30敲除可導(dǎo)致睪丸發(fā)育損傷和精子形成障礙，由于T 在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育和成熟過程中不可或缺，而INH-B 含量與精子密度、睪丸體積顯著相關(guān)，因此我們通過ELISA 法檢測了不同基因型小鼠睪丸組織勻漿液中T和INH-B 的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WW組和KW組比較，KK組小鼠睪丸組織勻漿液中睪酮T和INH-B 顯著下降(圖5)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明敲除SOX30基因可導(dǎo)致小鼠睪丸合成分泌T 和INH-B 能力減弱，進(jìn)而影響雄性小鼠生殖功能，提示SOX30可能是調(diào)控T 和INH-B 合成的重要分子之一。

圖4 SOX30敲除對小鼠睪丸及附睪病理形態(tài)學(xué)的影響

圖5 SOX30敲除對小鼠睪丸組織勻漿液中T及INH-B水平的影響(n=5)

2.6 SOX30 敲除對小鼠睪丸組織支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)的影響

睪丸組織是合成分泌生殖激素T 和INH-B 的主要場所，T 和INH-B 分別由睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞合成和分泌。為了進(jìn)一步分析SOX30對睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的影響，我們采用免疫熒光法分別對WW型和KK型小鼠睪丸組織支持細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白SOX9和間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD 的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。通過激光共聚焦顯微鏡觀察及熒光強(qiáng)度分析發(fā)現(xiàn)，SOX30敲除后WW 和KK 型小鼠睪丸組織中SOX9(紅色)表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(圖6B)，但KK型小鼠睪丸組織中3β-HSD蛋白(綠色)表達(dá)細(xì)胞較WW型小鼠明顯升高(圖6C)，提示SOX30敲除對小鼠睪丸支持細(xì)胞數(shù)目無明顯影響，但可以導(dǎo)致睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞代償性增生。

3 討 論

SOX家族由雄性性別決定基因Sry(sexdetermining region of Y chromosome)相關(guān)基因組成，廣泛參與性別決定、性腺發(fā)育和早期胚胎發(fā)育等一系列過程，是具有一段同源保守HMG-box DNA 結(jié)合域的基因超家族[12-13]。其中，SOX30基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的SOX家族基因，為SOX基因家族H 亞族的唯一成員。最近的研究已證實(shí)SOX30基因是精子形成所必需的[9-10]，SOX30的缺失可導(dǎo)致小鼠生殖細(xì)胞停滯在減數(shù)分裂后的圓形精子細(xì)胞早期[11]。盡管如此，有關(guān)SOX30基因在雄性生殖系統(tǒng)中的作用及機(jī)制的認(rèn)識尚不全面和明確。本研究發(fā)現(xiàn)，SOX30缺失可導(dǎo)致小鼠睪丸體積縮小，睪丸臟器系數(shù)顯著下降，睪丸組織內(nèi)曲細(xì)精管管腔直徑縮小，曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞分布異常，精子生成障礙。這些結(jié)果表明SOX30敲除可導(dǎo)致明顯的睪丸發(fā)育異常。另外，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)SOX30敲除可導(dǎo)致睪丸激素分泌異常。

T 是構(gòu)成雄激素的重要組分，在雄性主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成分泌。睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的T 一部分進(jìn)入血液循環(huán)，維持雄性第二性征，另一部分作用于睪丸生精上皮，參與精子發(fā)生及成熟[14-15]。睪酮在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育和成熟過程中不可或缺，生理劑量的T能維持精子的正常發(fā)育，睪丸內(nèi)T 合成障礙或降低會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)育受損[16-18]。通過對睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白3β-HSD 進(jìn)行免疫熒光染色，我們觀察到SOX30敲除組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增生和聚集，但ELISA 檢測結(jié)果表明SOX30敲除小鼠睪丸組織勻漿液中T 水平與WW 型和KW 型小鼠比較顯著下降，說明SOX30缺乏可導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞激素分泌功能異常，SOX30敲除導(dǎo)致的睪丸間質(zhì)增多可能是一種代償性的增生。這一現(xiàn)象與一些外源性化合物(如鄰苯二甲酸二丁酯)暴露導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞異常增殖和T水平下降類似[19-20]。

圖6 SOX30敲除對小鼠睪丸支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)的影響

INH-B 是雄性體內(nèi)重要的性激素，是由睪丸支持細(xì)胞合成分泌的一種糖蛋白，在男性生育功能中具有重要調(diào)節(jié)作用，是睪丸外分泌功能的指標(biāo)[21]。作為精子發(fā)生最重要的標(biāo)志物之一，INH-B濃度與睪丸體積和精子數(shù)量密切相關(guān)[22]，臨床不育患者血清中INH-B水平顯著下降[23]。有研究認(rèn)為，在評估男性不育癥方面，INH-B 是比其他激素更好的檢測指標(biāo)[24]，可作為術(shù)前睪丸潛在活性的可靠指標(biāo)，也可以預(yù)測精索靜脈曲張切除術(shù)后精子發(fā)生的機(jī)會(huì)，并使患者免于無用的手術(shù)[25]。也有報(bào)道支持細(xì)胞綜合征的發(fā)生與INH-B 高度相關(guān)，INH-B 水平能反映睪丸支持細(xì)胞的功能[26]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，SOX30敲除小鼠睪丸組織勻漿液中INH-B 濃度與WW 和KW 組小鼠比較明顯下降。為了進(jìn)一步分析KK 型小鼠睪丸INH-B 水平下降是不是由于支持細(xì)胞數(shù)目的改變所造成的，我們通過免疫熒光法檢測了睪丸支持細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白SOX9 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KK型小鼠睪丸組織中表達(dá)SOX9的細(xì)胞數(shù)量與WW 型小鼠比較無明顯差異。這些結(jié)果表明SOX30基因的缺失對睪丸支持細(xì)胞的數(shù)目無明顯的影響，但可導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞INH-B分泌功能異常，提示SOX30可能參與睪丸支持細(xì)胞激素分泌功能的調(diào)控。

綜上，本研究證實(shí)SOX30基因在小鼠生精過程中具有重要作用，初步證明SOX30能夠參與睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞激素分泌功能的維持，是調(diào)控睪丸T 和INH-B激素合成的重要分子之一，具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。