朱靜和 蔣鳳 吳加濱

（江蘇省鹽城市濱海縣人民醫(yī)院 濱海224500）

2型糖尿病（T2DM）以胰島素抵抗為特征，是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素[1]。AS已被認(rèn)為是許多心血管疾病的基本病理改變，血管病變的發(fā)展是T2DM患者死亡的主要原因之一[2]。單核細(xì)胞通過(guò)與受損血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的黏附分子結(jié)合，在AS進(jìn)展的第一步發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞遷移到內(nèi)皮下間隙成熟為巨噬細(xì)胞，最終分化成泡沫細(xì)胞，在炎癥部位釋放促炎和促氧化細(xì)胞因子[3]。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是炎癥反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物，可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙參與AS的發(fā)展[4]。丹參酮ⅡA是丹參中的一種親脂性藥理活性化合物，具有抗炎作用，并在各種炎癥條件下表現(xiàn)出保護(hù)作用[5]，但其在ox-LDL誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用尚不清楚。本研究探討丹參酮ⅡA對(duì)T2DM合并AS患者炎癥反應(yīng)的影響。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年2～9月收治的T2DM合并AS患者90例為研究對(duì)象，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（45例）和觀察組（45例）。T2DM的診斷與分類(lèi)依據(jù)《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2013年版）》[6]。AS通過(guò)血管造影診斷，符合美國(guó)心臟學(xué)會(huì)2013年發(fā)布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿??；合并T2DM急性并發(fā)癥；其他急性臨床情況或嚴(yán)重疾?。ㄈ鐕?yán)重肝腎功能不全、嚴(yán)重感染、膿毒癥或惡性腫瘤等）；其他內(nèi)分泌或自身免疫性疾病；服用可能影響全身致炎因子水平的激素制劑或免疫抑制劑等。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容知情并簽署知情同意書(shū)。兩組年齡、性別、單核細(xì)胞絕對(duì)值、血糖、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

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1.2 治療方法 對(duì)照組和觀察組均給予常規(guī)降血糖治療：二甲雙胍（國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370）0.5 g/次，口服，3次/d；阿卡波糖（國(guó)藥準(zhǔn)字H19990205）50 mg/次，隨餐服，3次/d。觀察組在標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加丹參酮ⅡA注射液治療，80 mg丹參酮ⅡA注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H31022558）加入250 ml 0.9%氯化鈉注射液稀釋?zhuān)o脈滴注，1次/d，療程為2周?？靥悄繕?biāo)：空腹血糖4.4～7.0 mmol/L，餐后2 h或隨機(jī)血糖＜10.0 mmol/L。常規(guī)藥物治療后，兩組患者血糖均達(dá)標(biāo)。

1.3 兩組治療前后血清細(xì)胞因子濃度檢測(cè) 抽取兩組用藥前后患者空腹靜脈血2 ml，離心分離血清，保存于-80℃用于批量檢測(cè)。利用Luminex200流式熒光檢測(cè)儀，據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)（美國(guó)密理博公司）提供的操作步驟檢測(cè)腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì) 胞 介 素（IL）-6、IL-1β和 細(xì) 胞 間 黏 附 分 子-1（ICAM-1）濃度，每個(gè)樣本檢測(cè)2次，取均值。

1.4 分離培養(yǎng)健康供者及T2DM合并AS患者外周血單核細(xì)胞 于治療前采集健康供者5例及T2DM合并AS患者5例外周血8 ml，250 g離心20 min，去除上層（富含血小板）；剩余血液與生理鹽水混合，650 g離心20 min，進(jìn)行葡聚糖沉降，收集上層（富含白細(xì)胞），室溫下500 g離心5 min，將顆粒重新懸浮在含葡萄糖的Hank's平衡鹽溶液中。利用Percoll密度梯度在700 g下進(jìn)行離心15 min，收集界面層并用含葡萄糖的Hank's平衡鹽溶液洗滌。將顆粒重新懸浮在含有10%FBS的RPMI-1640中黏附單核細(xì)胞1 h。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力約95%，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+細(xì)胞純度約95%。

1.5 體外刺激培養(yǎng)健康供者及T2DM合并AS患者單核細(xì)胞 收集上述培養(yǎng)細(xì)胞，分為6組：A組健康供者空白組；B組健康供者ox-LDL（北京索萊寶科技有限公司）處理組；C組健康供者丹參酮ⅡA（美國(guó)Sigma公司）+ox-LDL處理組；D組T2DM合并AS患者空白組；E組T2DM合并AS患者ox-LDL處理組；F組T2DM合并AS患者丹參酮ⅡA+ox-LDL處理組。丹參酮ⅡA（1μm）培養(yǎng)1 h后，加或不加ox-LDL（40μg/ml）繼續(xù)孵育48 h，收集細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 單核細(xì)胞中致炎因子水平檢測(cè) 收集上述分組細(xì)胞，采用RT-PCR（Applied Biosystems公司）檢測(cè) 各 組 細(xì) 胞IL-1βmRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平。采用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA，通過(guò)QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：IL-1β，正義鏈5'-CTCTCACCTCCTACTCAC-3'，反義鏈5'-ACACT GCTACTTTCCCC-3'；IL-6，正義鏈5'-CCACTGCCT TCCCTACTTCA-3'，反義鏈5'-TGGTCCTTAGCCA CTCCTTC-3'；TNF-α正義鏈5'-GCAGAAAATGCC AGGATGATG-3'，反義鏈5'-GGCTGTCAGAGCCT CGTGGCTTTGG-3'；ICAM-1，正義鏈5'-AAAAGCG GAGACAGGAGACA-3'，反義鏈5'-AGCACGAGAA GCTCAGGAGA-3'；β-肌動(dòng)蛋白，正義鏈5'-CTGGG CTACACTGAGCACC-3'，反義鏈5'-AAGTGGTCG TTGAGGGCAATG-3'。采用三步循環(huán)方案，95℃初始變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s進(jìn)行擴(kuò)增。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣品和校準(zhǔn)樣品之間的相對(duì)折疊差，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)標(biāo)計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism7.0軟件。計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后血清細(xì)胞因子濃度比較 兩組治療前血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1濃度比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與對(duì)照組及觀察組用藥前相比，觀察組在使用丹參酮ⅡA 2周后血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1濃度明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組治療前后血清細(xì)胞因子濃度比較（pg/ml，±s）

表2 兩組治療前后血清細(xì)胞因子濃度比較（pg/ml，±s）

注：與對(duì)照組用藥前比較，*P＜0.05；與觀察組用藥前比較，#P＜0.05。

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2.2 丹參酮ⅡA+ox-LDL處理后單核細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 與空白對(duì)照組相比，ox-LDL處理組單核細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；與ox-LDL處理組相比，丹參酮ⅡA+ox-LDL處理組單核細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。T2DM合并AS患者空白組單核細(xì)胞凋亡率與健康供者空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與健康供者ox-LDL處理組相比，T2DM合并AS患者ox-LDL處理組單核細(xì)胞凋亡率增加（t=2.645；P=0.021 4）；與健康供者丹參酮ⅡA+ox-LDL處理組相比，T2DM合并AS患者丹參酮ⅡA+ox-LDL處理組單核細(xì)胞凋亡率增加（t=2.721，P=0.018 6）。見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組單核細(xì)胞凋亡率檢測(cè)（%，±s）

表3 各組單核細(xì)胞凋亡率檢測(cè)（%，±s）

注：與A組比較，t=6.663，*P=0.000 2，與B組比較，t=7.285，#P＜0.000 1；與D組比較，t=4.213，**P=0.002 9，與E組比較，t=4.074，##P=0.003 6。

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圖1 各組單核細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

2.3 丹參酮ⅡA抑制健康供者及T2DM合并AS患者單核細(xì)胞中炎癥介質(zhì)表達(dá) 體外通過(guò)ox-LDL及丹參酮ⅡA培養(yǎng)健康供者及T2DM合并AS患者單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，ox-LDL處理組單核細(xì)胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與ox-LDL處理組相比，丹參酮ⅡA+ox-LDL處理組單核細(xì)胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4、表5。

表4 健康供者單核細(xì)胞中炎癥介質(zhì)表達(dá)（±s）

表4 健康供者單核細(xì)胞中炎癥介質(zhì)表達(dá)（±s）

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表5 T2DM合并AS患者單核細(xì)胞中炎癥介質(zhì)表達(dá)（±s）

表5 T2DM合并AS患者單核細(xì)胞中炎癥介質(zhì)表達(dá)（±s）

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3 討論

AS是T2DM常見(jiàn)的并發(fā)癥，常進(jìn)展為心肌梗死和腦卒中，是T2DM患者致殘和致死的重要原因。導(dǎo)致AS發(fā)展的危險(xiǎn)因素包括高血糖、低密度脂蛋白膽固醇升高和TG升高。與糖尿病相關(guān)的脂蛋白紊亂通過(guò)促進(jìn)斑塊和ox-LDL在血管系統(tǒng)中的積聚在AS的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。AS是一種心血管疾病過(guò)程，脂質(zhì)斑塊形成并聚集在中等大小的動(dòng)脈內(nèi)膜上，導(dǎo)致動(dòng)脈管壁硬化，動(dòng)脈變窄，最終導(dǎo)致動(dòng)脈阻塞，從而阻止血管系統(tǒng)發(fā)揮提供充足氧氣和營(yíng)養(yǎng)的功能，并破壞全身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[9]。與正常人群相比，糖尿病患者患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)高出4倍以上[10]。

先天免疫反應(yīng)和炎癥的主要調(diào)節(jié)因子是單核巨噬細(xì)胞，它們參與先天免疫和炎癥相關(guān)的病理過(guò)程，包括自體炎癥疾病、膿毒癥、癌癥或AS[11]。單核巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的許多先天功能是由細(xì)胞因子介導(dǎo)的。IL-6、TNF-α及IL-1是先天炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)。本次通過(guò)對(duì)AS患者促炎性細(xì)胞因子的研究，以考察丹參酮ⅡA對(duì)該病的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組及觀察組用藥前相比，觀察組在使用丹參酮ⅡA2周后血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1濃度明顯降低。

單核細(xì)胞通過(guò)與受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的黏附分子結(jié)合，遷移到內(nèi)皮下空間，成熟為巨噬細(xì)胞，并通過(guò)A類(lèi)清道夫受體和CD-36攝取氧化低密度脂蛋白，最終分化成泡沫細(xì)胞，在炎癥部位釋放促炎和促氧化細(xì)胞因子[3]。AS是與ox-LDL積聚有關(guān)的主要心血管疾病之一[12]。最近的報(bào)道表明，ox-LDL可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，包括IL-1β、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白1，黏附分子包括ICAM-1和E-選擇素，下調(diào)Kruppel-like factor 2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而推動(dòng)AS的發(fā)生[8]。

為了進(jìn)一步說(shuō)明丹參酮ⅡA在AS疾病過(guò)程中的抑炎作用，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)建立ox-LDL刺激單核細(xì)胞的炎癥模型。發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，ox-LDL處理組單核細(xì)胞凋亡率增加，單核細(xì)胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)升高；與ox-LDL處理組相比，丹參酮ⅡA+ox-LDL處理組單核細(xì)胞凋亡率降低，單核細(xì)胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯降低。

IL-1β在AS和心血管事件的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，使用IL-1阻斷劑與降低總體主要心血管不良事件（MACE）、不穩(wěn)定型心絞痛和心力衰竭復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[13]。IL-6是一種重要的致AS的細(xì)胞因子[14]。這種多功能促炎性細(xì)胞因子由T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，并通過(guò)其膜結(jié)合受體或可溶性受體發(fā)揮作用[15]。IL-6在血管壁對(duì)單核細(xì)胞的自分泌和旁分泌的激活有助于炎癥沉積。IL-6還降低血漿中脂蛋白脂肪酶活性和單體脂蛋白脂肪酶水平，從而增加巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取，從而導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成。在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，促炎性細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α等）與血管炎癥有關(guān)[16]。TNF-α在單核細(xì)胞黏附和內(nèi)皮功能障礙方面具有協(xié)同效應(yīng)。IL-6通過(guò)反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加內(nèi)皮細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子（如ICAM-1等）的表達(dá)。

綜上所述，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)觀察組在使用丹參酮ⅡA2周后，患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1濃度明顯降低。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參酮ⅡA可顯著降低ox-LDL處理的單核細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子表達(dá)，這些結(jié)果表明丹參酮ⅡA具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡的性質(zhì)，有望緩解T2DM患者AS的進(jìn)程。但本次所選病例較少，藥物治療周期較短，后續(xù)仍需大量實(shí)驗(yàn)多方面驗(yàn)證丹參酮ⅡA的抗炎效能。