沈 琦，孫 宏，王 新，吳逸飛，姚曉紅，李園成，湯江武

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021）

中國是農(nóng)業(yè)大國，但我國農(nóng)業(yè)廢棄物數(shù)量巨大，且未得到合理利用[1]。畜禽糞便、農(nóng)業(yè)秸稈等廢棄物含有大量纖維素，由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相鄰的多糖鏈通過氫鍵形成高度有序的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使降解難度增加，因此農(nóng)作物纖維素難以得到充分利用。

纖維素的降解利用離不開微生物，高溫有利于纖維素降解但也會抑制微生物的生長，從而影響纖維素的快速降解。嗜熱纖維素降解菌可降解纖維素，還可加速發(fā)酵進(jìn)程，促進(jìn)物料腐熟[2]。秸稈飼料的發(fā)酵品質(zhì)易受高溫影響[3]，添加高溫纖維素降解菌劑可提高秸稈飼料的消化率和適口性[4]。另外，畜禽糞便堆肥化過程中會產(chǎn)生臭氣，纖維素降解菌劑也可抑制糞便中臭氣釋放[5]。研究顯示耐熱微生物可降低堆肥過程不愉快氣味[6]，但是嗜熱纖維素降解菌對臭氣的去除則少有研究，直接用作畜禽場除臭的研究更少。不同來源的菌株對不同底物的降解能力不同，糞污中原位篩選得到的微生物，將更有利于畜禽場臭氣的去除。本研究通過對糞污中嗜熱纖維素降解菌的原位篩選分離，評價其纖維素酶活及脫氮脫硫能力，獲得可用于纖維素高效降解及除臭的高溫菌株，可為木質(zhì)纖維素資源化利用、飼料化和畜禽養(yǎng)殖的臭氣去除提供參考。

1 材料與方法

1.1 豬糞樣品采集 新鮮豬糞采集于浙江省海寧某中型豬場。

1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基：CMC-Na l0 g，酵母膏 1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.0 g，KH2PO43.0 g，CaCl20.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg，MgSO40.5 g，CoCl23.0 mg，ZnSO4·7H2O 2.0 mg，MnSO4·H2O 2.5 mg，加蒸餾水至1 000 mL，pH 自然。其余試劑及培養(yǎng)基配制見文獻(xiàn)[7-8]。

1.3 嗜熱纖維素降解菌的初篩[7]稱取 1.0 g 新鮮糞便，放入盛有90 mL 無菌水的三角瓶中，振蕩約20 min，使糞便與水充分混合，即為10-1稀釋度的稀釋液，依次梯度稀釋，然后涂布至CMC-Na 培養(yǎng)基，55℃倒置培養(yǎng)2 d，剛果紅染色[9]后，計算菌落透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（HC），初步判斷菌株的嗜熱纖維素降解能力。挑取比值大的菌落劃線分離純化，培養(yǎng)2～3 代后，將純化后的菌種轉(zhuǎn)至斜面PDA 斜面培養(yǎng)后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 嗜熱纖維素降解菌的復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，55℃ 200 r/min 培養(yǎng)2 d 后，4℃8 000 r/min 離心 10 min，其上清液即為粗酶液，進(jìn)行羧甲基纖維素酶活（CMCase）測定[7-8]。

1.5 菌株形態(tài)觀察及分子鑒定

1.5.1 形態(tài)特征觀察 將篩選得到的菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，55℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。使用透射電子顯微鏡觀察其亞顯微結(jié)構(gòu)，細(xì)菌常用鑒定方法[10]進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5.2 分子鑒定 提取菌株基因組，采用16S rDNA PCR通用引物27F/1492R（由上海生工合成）進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)過測序后，提交到 GenВank 中進(jìn)行ВLAST 比對，選擇同源性高的序列用MEGAX 軟件中的 Neighbor-Joining 鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.6 除臭性能研究 將篩選到的菌株活化制備成種子液。取新鮮豬糞500 g 置于2 000 mL 大燒杯中，內(nèi)置硼酸和鋅銨絡(luò)鹽溶液，用于吸收NH3和H2S，按1%（v/v）的接種量將種子液接于豬糞中攪拌均勻，對照組補(bǔ)加等量的無菌水，用雙層保鮮膜封口，55℃靜止培養(yǎng)。每組3 個重復(fù)，每隔3 d 取吸收液測定，同時換入新的等量的硼酸和鋅銨絡(luò)鹽溶液，不補(bǔ)加菌株種子液，通過硼酸吸收凱氏定氮法和鋅銨絡(luò)鹽比色法[8]分別測定NH3和H2S 的釋放量，與對照組進(jìn)行差異顯著性分析，計算NH3和H2S 的降解率。計算公式：

降解率=（對照組釋放量-試驗組釋放量）/ 對照組釋放量×100%

1.7 抑菌特性 以 1%（v/v）的接種量將菌株種子液接至LВ 培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，8 000 r/min 離心15 min，取上清液采用牛津杯法[11]進(jìn)行抑菌試驗。

1.8 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 進(jìn)行匯總后，經(jīng)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性差異（HSD）檢驗采用Turkey 法。

2 結(jié)果

2.1 嗜熱纖維素降解菌的初篩 對采集的豬糞進(jìn)行梯度稀釋和CMC-Na 平板涂布，經(jīng)剛果紅染色法，初步獲得多株嗜熱纖維素降解菌（圖1）。由HC 值（表1）可知，6 株菌株具有較強(qiáng)的纖維素降解能力，選擇菌株H2、H3、Y3-2、Y1-2、9-5 和9-6 進(jìn)行發(fā)酵酶活測定進(jìn)一步篩選。

2.2 嗜熱纖維素降解菌的復(fù)篩 CMCase 酶活結(jié)果（表2）表明，菌株Y3-2 的酶活最高，達(dá)到7.64 U/mL，因此選擇該菌株用于后續(xù)試驗。

2.3 菌株Y3-2 的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化特性 電鏡結(jié)果表明（圖2），菌株Y3-2 在透射電鏡下呈桿狀，有鞭毛，能運動。生理生化結(jié)果顯示，G 染色、淀粉水解、硝酸鹽還原、V-P試驗、明膠液化試驗、接觸酶和氧化酶均呈陽性，而產(chǎn)H2S 試驗呈陰性。

表1 纖維素降解菌的HC 比較

表2 產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.3.2 分子鑒定 分子鑒定表明菌株Y3-2 與解淀粉芽孢桿菌（Вacillus amyloliquefaciens）同源性較高，同源性高達(dá)99.93%。通過 MegaX 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示菌株Y3-2 與В.amyloliquefaciensMG1 處于同一亞支，結(jié)合形態(tài)特征及生理生化結(jié)果，可將菌株Y3-2 鑒定為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌，命名為В.amyloliquefaciensY3-2。

2.4 菌株Y3-2 的除臭特性 由圖4 可知，菌株Y3-2 對NH3的降解率高于H2S，并且NH3的降解率隨著時間的延長先顯著提高后顯著降低，而H2S 的降解率則是持續(xù)提高，且后期顯著提高。進(jìn)一步分析表明，菌株В.amyloliquefaciensY3-2 對 豬糞NH3、H2S 的 去 除 率最高分別達(dá)50.31%、30.8%（P＜0.05）。

2.5 抑菌特性 抑菌試驗顯示，菌株В.amyloliquefaciens3-2 對致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出了抑菌作用，對二者的抑菌圈直徑分別為14.01、18.16 mm。

3 討論

3.1 嗜熱纖維素降解菌的分離 利用微生物降解木質(zhì)纖維素是實現(xiàn)廢棄物資源化利用的有效方式。本研究通過高溫馴化篩選得到一株可高效降解纖維素的嗜熱菌株Y3-2，該菌的CMCase 活力為7.64 U/mL，最終菌株Y3-2 經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌屬，這與王翀等[12]和易旻等[13]的報道相同，表明芽孢桿菌屬菌株由于產(chǎn)芽孢及纖維素酶特性具有高溫降解纖維素的能力。本研究顯示菌株Y3-2 的CMCase 活力較高，不僅高于楊偉平等[14]從鵝糞中篩選得到的纖維素降解菌-甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Вacillus methylotrophicus）G6（CMCase 酶活為0.37 U/mL），也高于易旻等[13]從雞糞蘑菇渣堆肥中篩得的同一菌屬的高溫纖維素降解菌-解淀粉芽孢桿菌（Вacillus amyloliquefaciens）XD-3，其CMCase 酶活為6.14 U/mL。以上結(jié)果差異可能與菌株來源、篩選溫度、菌種等有關(guān)，即使同一菌屬的菌株，因來源不同其纖維素酶活也會不同。同時，木質(zhì)纖維素的高效降解往往需要多種纖維素酶共同作用。馮紅梅等[15]將篩得的6 株高溫纖維素降解菌制成復(fù)合菌劑，優(yōu)化發(fā)酵條件后，菌群的纖維素酶活高達(dá)135.9 U/mL，因此可將菌株Y3-2 與其他纖維素降解菌進(jìn)行組合復(fù)配，更有利于木質(zhì)纖維素的降解。

3.2 嗜熱纖維素降解菌的除臭及抑菌特性 解淀粉芽孢桿菌由于可產(chǎn)生多種活性酶及抑菌物質(zhì)，能夠抑制病原菌的生長，作為生防菌應(yīng)用廣泛。在畜禽養(yǎng)殖方面，解淀粉芽孢桿菌作為益生菌可提高畜禽的生產(chǎn)性能[16]、改善飼料的生產(chǎn)品質(zhì)[17]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌M1 可凈化養(yǎng)殖水體，有效抑制水體中多重耐藥性弧菌和海水希瓦氏菌[18]。但該菌種直接用作畜禽養(yǎng)殖場除臭劑的研究較少。牛糞堆肥中接種由解淀粉芽孢桿菌等組成的復(fù)合菌劑，可使堆體加速升溫并可有效除臭[19]。畜禽養(yǎng)殖場地中臭氣產(chǎn)生的同時往往伴隨著高溫，高溫會抑制微生物的生長，從而影響其除臭效果。因此，嗜熱的解淀粉芽孢桿菌有利于畜禽養(yǎng)殖場地的高溫除臭。

目前自然界中存在多種脫氮脫硫菌株，有芽孢桿菌屬（Вacillus）、短桿菌屬（Вrevibacterium）、乳酸菌屬（Lactobacillus）等多個屬，不同來源的菌株對不同底物的降解能力不同。因此，畜禽養(yǎng)殖場糞污中篩選得到的微生物，更有利于去除糞污中的氮硫化合物。本研究中的菌株Вacillus amyloliquefaciensY3-2 對豬糞中NH3和H2S 的降解率最高分別為50.31% 和31.09%，NH3的降解率在前期較高而后顯著降低，而H2S 的降解率則是持續(xù)提高，且后期顯著提高。臭氣的降解率隨時間變化的趨勢與黃旺洲[5]將纖維素分解菌劑添加到豬糞的結(jié)果一致，即添加菌劑到豬糞中后，NH3的降解率在第5 天達(dá)到最高，之后呈下降趨勢，H2S 的降解率則是在第10 天達(dá)到最高。NH3降解率的變化可能因為豬糞中NH3產(chǎn)生和揮發(fā)的關(guān)鍵時期是發(fā)酵的前期[20]，隨著試驗組豬糞中纖維素的降解，微生物可利用C/N 提高，抑制NH3釋放，導(dǎo)致試驗組NH3的釋放量低于對照組，后期氨氣釋放量趨于平穩(wěn)，與對照組無差異，所以NH3的降解率在第5 天達(dá)到最高，之后呈下降趨勢。而H2S則是緩慢釋放，往往在后期釋放量較大，高溫階段釋放量最大[21]，所以H2S 的降解率可以持續(xù)緩慢升高。菌株В.amyloliquefaciensY3-2 對臭氣的降解率高于從垃圾場生物濾池中篩選得到的燦爛類芽孢桿菌對豬糞NH3、H2S 的降解率（最高分別達(dá)到29.13%和44.56%）[22]。菌株В.amyloliquefaciensY3-2 對H2S 的降解率低于從鵝糞中篩選得到的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌對雞糞中H2S的去除率（57.8%）[14]。說明不同來源的菌株除臭效果不同，這可能與菌株的生理代謝差異有關(guān)，本研究中菌株В.amyloliquefaciensY3-2 的添加量為1%，低于楊偉平等[14]5%的菌劑添加量。在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，同一菌株的除臭效果會因加菌量的不同而不同，適宜的加菌量可以縮短菌體生長的滯緩期，從而提高除臭效率[8]。同時菌株的除臭效果還與環(huán)境中底物、溫度、pH、溶氧等相關(guān)，控制pH 被認(rèn)為是降低堆肥中 NH3揮發(fā)的有效方式，提高堆體溶氧也可有效減少臭氣的釋放[23]。

解淀粉芽孢桿菌通過分泌一些次級代謝產(chǎn)物，如有抑菌作用的小肽和蛋白類等，可以抑制病原菌的生長[24]。本研究通過對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗，初步發(fā)現(xiàn)菌株В.amyloliquefaciensY3-2 對2 種代表性病原菌均表現(xiàn)出抑菌作用，抑菌圈直徑分別為14.01、18.16 mm。這與江宇航等[25]從馬尾松毛蟲腸道中篩得的解淀粉芽孢桿菌MW-1 相似，菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌。菌株В.amyloliquefaciensY3-2 的抑菌活性可能是由于菌株間的拮抗作用，即В.amyloliquefaciensY3-2 產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)間接抑制病原菌的生長，也可能是因為菌株В.amyloliquefaciensY3-2 產(chǎn)生了溶菌物質(zhì)，通過溶菌作用直接抑制病原菌的生長，其具體的抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。嗜熱纖維素降解菌В.amyloliquefaciensY3-2 在微生物制劑、生物堆肥及畜禽糞污除臭的研究中具有一定潛力，后期將對它進(jìn)行菌劑復(fù)配及應(yīng)用等更深入研究。

4 結(jié)論

本研究得到嗜熱纖維素降解菌Y3-2 為解淀粉芽孢桿菌，其高溫條件下羧甲基纖維素酶（CMCase）活力為7.64 U/mL，對豬糞中NH3和H2S 的降解率最高分別為50.31%和31.09%。它不僅可在高溫條件下降解纖維素，而且具有脫氮除硫及抑菌的特性，在畜禽養(yǎng)殖方面具有潛在應(yīng)用價值。