彭超超 ，劉興能，岳 丹，朱俊紅，熊和麗,2，李 靜,3，和曉明，席冬梅，鄧衛(wèi)東*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650201；3.公安部昆明警犬基地，云南昆明 650201）

血小板衍生生長因子（Platelet-Derived Growth Factor，PDGF）基因家族及其受體參與血管生成和小鼠性腺中類固醇激素的產(chǎn)生[1]。該基因家族成員——血小板衍生生長因子受體樣蛋白（Platelet-Derived Growth Factor Receptor-Like，PDGFRL）是一種與血小板衍生生長因子受體β配體胞外結(jié)構(gòu)域具有顯著的序列相似性的蛋白質(zhì)，由PDGFRL基因編碼，在雞生殖系統(tǒng)中作為類固醇分泌反饋調(diào)節(jié)機(jī)制中的調(diào)節(jié)器[2-4]。PDGFRL基因是一種腫瘤抑制基因，該基因突變或含有該基因的染色體片段缺失與發(fā)散性肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌有關(guān)，在個別癌癥樣本中已發(fā)現(xiàn)PDGFRL基因的突變[5-7]。然而，PDGFRL 蛋白具體生物學(xué)功能尚不清楚。最近有研究表明，乳腺癌來源的MDA-231 細(xì)胞增殖在PDGFRL 過表達(dá)時被抑制[4]。前人研究表明，隨著黑色素瘤的生長，PDGFRL表達(dá)在從非轉(zhuǎn)移性表達(dá)水平向轉(zhuǎn)移性表達(dá)水平過渡期間有所下降[3]。越來越多的研究表明，PDGFR 在自身免疫性疾病（包括干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）的發(fā)病機(jī)制和自身免疫性疾病的小鼠模型（1 型糖尿病、多發(fā)性硬化等）中起關(guān)鍵作用，而PDGFRL 對PDGFR信號傳導(dǎo)又具有調(diào)控作用，故PDGFRL 可能與多種自身免疫性疾病有關(guān)[8-12]。黑色素也可以通過限制體外和體內(nèi)免疫缺陷病毒的生長來增加人體免疫力，色素沉著在免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用[13-14]。

2001 年，毛華明等[15]考察蘭坪時發(fā)現(xiàn)烏骨綿羊，烏骨綿羊毛色與普通綿羊相似，但烏骨綿羊的牙齦是褐色或淡黑色，眼結(jié)膜為淡烏色，肛門為烏黑色，對烏骨綿羊解剖后發(fā)現(xiàn)其具有烏色的肌肉、骨骼、內(nèi)臟、氣管等性狀，并且烏色性狀隨年齡增大而逐漸加深。由于當(dāng)?shù)貙儆阢U鋅礦的重要產(chǎn)地，起初判斷其烏肉特征是由于鉛鋅中毒導(dǎo)致，但經(jīng)過檢測判斷是由于其體內(nèi)基因作用而形成“烏骨烏肉”特征，并具有遺傳現(xiàn)象[16]。蘭坪烏骨綿羊是目前世界已知唯一具有烏質(zhì)性狀的哺乳動物，屬于珍稀地方品種資源，其主要產(chǎn)地為云南省蘭坪縣[15]。并且同樣的飼養(yǎng)管理條件下，烏骨綿羊體內(nèi)總抗氧化能力、抗超氧陰離子活力、酪氨酸酶活力、谷胱甘肽過氧化酶等均高于普通綿羊[17-19]。烏骨綿羊體內(nèi)黑色素含量高，黑色素在人體內(nèi)可以富集微量元素；黑色素自由基具有光保護(hù)作用，避免紫外線對皮膚的傷害；另外，黑色素的抗氧化能力能有效增強(qiáng)人體抵抗力[20-21]，這些作用都將促進(jìn)烏骨綿羊藥用價值和食用價值的發(fā)掘。但目前關(guān)于烏骨綿羊種質(zhì)的分子特征研究甚少，對于烏骨綿羊烏質(zhì)性狀相關(guān)研究大部分是黑色素生物合成途徑及酶調(diào)控位點相關(guān)基因的研究。本研究通過PCR技術(shù)擴(kuò)增PDGFRL基因編碼區(qū)序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而揭示烏骨綿羊PDGFRL基因的生物學(xué)特性，為后續(xù)研究PDGFRL 是否會對黑色素細(xì)胞的增殖、表達(dá)產(chǎn)生抑制或促進(jìn)以及PDGFRL 和黑色素在對烏骨綿羊免疫作用中是否具有協(xié)同作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實驗動物為來自蘭坪的蘭坪烏骨綿羊25只，使用一次性真空采血管（檸檬酸鈉1：9）靜脈采血，血樣采集后，利用血液基因組DNA 純化試劑盒提取綿羊血液DNA，保存于pH 為8 的TE 緩存液，置于-20℃條件下備用。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 實驗儀器 80-2 臺式電動離心機(jī)（蘇州威爾實驗用品有限公司）、LDZX 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）、DHG 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司）、海爾臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜（青島海爾特種電冰柜有限公司）、TG16-WS臺式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限公司）、XK-400 手掌離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）、LifeECO 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）、ESW-ΙV 超純水系統(tǒng)（上海茸研儀器有限公司）、JEA102 千分之一電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、美的微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）、DYY-6C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀電源（北京市六一儀器廠）、DYCP-31DN 水平式電泳槽（北京市六一儀器廠）、培清JS-780 全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）等。

1.2.2 實驗試劑 蛋白酶K（Merck 原裝）、RNase（北京天根生化科技有限公司）、ddH2O（北京天根生化科技有限公司）、無水乙醇（北京化工廠）、漂洗液（北京化工廠）、洗脫液（北京化工廠）、瓊脂糖（北京天根生化科技有限公司）、金牌MΙX（昆明碩擎生物技術(shù)有限公司）、TAE 緩沖液（北京化工廠）、TE 緩存液（北京化工廠）、ExRed 核酸染料（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）、DL2000 DNA Marker（昆明碩擎生物技術(shù)有限公司）等。

1.3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)綿羊26 號染色體（序列號：NC_040277）上的PDGFRL基因序列，利用Premier premier 6.0 軟件設(shè)計6 對外顯子引物，隨后在NCВΙ 在線 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）進(jìn)行引物特異性檢驗，設(shè)計好后送至昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成PCR 引物。PDGFRL基因6 對引物序列及相關(guān)信息見表1。

1.4 PCR 擴(kuò)增及測序 PCR 反應(yīng)為25.0 μL 的反應(yīng)體系，其中含DNA 模板（20 ng/ μL） 1 μL、金牌MΙX（green）22 μL、上下引物（10 μmol/L）各1 μL。多次探究后設(shè)定不同引物PCR 反應(yīng)條件，Exon1-Exon3、Exon5 反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，退火溫度見表1，退火10 s，72℃延伸10 s，30 個循環(huán)，72℃后延伸1 min；Exon4、Exon6 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，退火溫度見表1，退火10 s，72℃延伸10 s，30 個循環(huán)，72℃后延伸1 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送至昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 烏骨綿羊PDGFRL基因序列及其生物信息學(xué)分析利用Chromas 軟件對所測序列進(jìn)行人工校對，對于波峰比較好的序列用于下一步分析，然后運用clustalx 軟件將所測序列和參考序列進(jìn)行比對，尋找變異位點，獲得開放閱讀框；將烏骨綿羊與GenВank 中公布的與其核苷酸編碼區(qū)序列和相應(yīng)氨基酸序列相似性較大的人、綿羊、山羊、滇金絲猴、狗、牛、馬、豬、鹿、蝙蝠、白鰭豚進(jìn)行比對分析，利用MEGA-X 軟件中的NJ 法重建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用DNAMAN 軟件和ExPASy-Translate tool 數(shù)據(jù)庫在線工具進(jìn)行氨基酸排列組分及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；利用DNAMAN9.0 軟件對PDGFRL 蛋白進(jìn)行疏水性分析；利用TMHMM Server v.2.0 在線工具對蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析；利用Signal ΙP 5.0 進(jìn)行信號肽預(yù)測；亞細(xì)胞定位預(yù)測利用PSORT ΙΙ Prediction；利用NPS@SOPMA 在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用SWΙSS-MODEL 在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

2.結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分析 如圖1 所示，電泳片段清晰明亮且電泳條帶清晰無非特異性條帶，測序后所得的6 對引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別為449、802、592、484、462、796 bp，與預(yù)期相符。將6 段序列與引物源序列進(jìn)行比對及序列拼接，獲得的序列總長度為1 128 bp。

2.2 烏骨綿羊PDGFRL 蛋白質(zhì)分析

2.2.1 CDS 序列蛋白翻譯 如圖2 所示，PDGFRL 蛋白由375 個氨基酸組成，氨基酸組成及含量如圖3，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為41.87 ku，等電點PΙ 為8.93。共發(fā)現(xiàn)3 個堿基突變位點（Exon2 上1 個，Exon5 上2 個），堿基突變類型均為同義突變，分別為：G138A、T865C和G893T，沒有引起相應(yīng)氨基酸的變化，3 個變異位點基因型峰圖結(jié)果如圖4。

2.2.2 綿羊PDGFRL 蛋白的分子特征 蛋白質(zhì)疏水性分析顯示PDGFRL基因編碼的整段氨基酸序列親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域，因此表明PDGFRL 蛋白整體表現(xiàn)為親水性。TMHMM Server 分析結(jié)果顯示烏骨綿羊PDGFRL 蛋白沒有跨膜區(qū)，表明PDGFRL 蛋白不是與膜細(xì)胞受體傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，不是膜受體蛋白質(zhì)。Signal ΙP serve 分析結(jié)果如圖5，SP 值為0.990 3，說明烏骨綿羊PDGFRL 蛋白存在信號肽，推測信號肽位置位于第21 氨基酸序列，屬于分泌性蛋白。PSORT ΙΙ Prediction 亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示PDGFRL 蛋白質(zhì)在線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外等均有分布，主要定位在細(xì)胞外。NPS@SOPMA 預(yù)測PDGFRL 蛋白二級結(jié)構(gòu)如圖6 所示，該蛋白有46 個氨基酸參與α螺旋（H），占總含量的12.27%；有100 個氨基酸參與延伸鏈（E），占總含量的26.67%；有26 個氨基酸參與β轉(zhuǎn)角（T），占總含量的6.93%；有203 個氨基酸參與無規(guī)則卷曲（C），占總含量的54.13%。SWΙSS-MODEL 同源建模烏骨綿羊PDGFRL 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7。

2.3 烏骨綿羊及部分物種PDGFRL基因核苷酸編碼區(qū)序列和相應(yīng)氨基酸序列分析 烏骨綿羊及人、綿羊、山羊、滇金絲猴、狗、牛、馬、豬、鹿、蝙蝠、白鰭豚等11 個物種PDGFRL基因編碼區(qū)核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列比對結(jié)果見表2，其中與綿羊、山羊、牛和鹿等反芻哺乳動物核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列同源性相對較高，與綿羊的同源性最高，分別達(dá)到99.73% 和100%。利用MEGA-X 軟件中的NJ 法構(gòu)建的烏骨綿羊和其他12 個物種PDGFRL基因氨基酸序列分子系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖8，烏骨綿羊和4 種反芻動物與白鰭豚各自為一類聚在一起，它們和豬又歸為一大類；其他5 個物種又歸為一大類，滇金絲猴和人聚在一起。

表2 烏骨綿羊與其他11 個物種PDGFRL基因編碼區(qū)核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列相似性

3 討論

迄今為止，有關(guān)PDGFRL基因的研究主要集中在人類、雞和小鼠上面。前人研究表明PDGFRL 有助于維持軟骨細(xì)胞的增殖，在軟骨細(xì)胞分化過程中可以抑制其終端分化[4]。Hou 等[22]對PDGFRL突變基因進(jìn)行SNP 分析揭示PDGFRL基因突變與中國漢族人患貝賽特氏癥密切相關(guān)。景洋等[23]通過RT-PCR 及免疫組化技術(shù)從mRNA 水平上發(fā)現(xiàn)PDGFRL基因?qū)Φ半u卵泡生長發(fā)育過程起著重要調(diào)節(jié)作用。但在綿羊乃至所有反芻動物上仍沒有相關(guān)報道。本研究首次采用PCR 擴(kuò)增烏骨綿羊PDGFRL基因外顯子序列并對序列進(jìn)行拼接，獲得的開放閱讀框總長度為1 128 bp，烏骨綿羊和普通綿羊PDGFRL基因編碼區(qū)序列同源性達(dá)到99.73%，有3 個堿基位點發(fā)生同義突變，沒有引起相應(yīng)氨基酸變化，編碼由375 個氨基酸序列組成的分泌型蛋白質(zhì)，其信號肽位置為21aa。這與Guo 等[24]研究結(jié)果一致，表明烏骨綿羊可能和人類PDGFRL基因具有同樣功能，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。G138A、T865C 和G893T 3 個突變位點是否會抑制細(xì)胞增殖仍需要進(jìn)一步對突變位點進(jìn)行多態(tài)性分析。

利用NCВΙ 數(shù)據(jù)庫搜索，將烏骨綿羊與不同物種PDGFRL基因編碼區(qū)核苷酸及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，PDGFRL基因編碼區(qū)序列在不同物種間具有高度相似性（>85.65%），說明烏骨綿羊PDGFRL基因編碼區(qū)在物種進(jìn)化過程中較為保守。根據(jù)12 個物種的PDGFRL基因編碼區(qū)序列重建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，羊、牛和鹿等反芻動物均為偶蹄目反芻動物亞目聚為一類，它們和豬又歸為一大類；其他5 個物種又歸為一大類，滇金絲猴和人均為靈長目聚在一起。

在信息學(xué)飛速發(fā)展的今天，利用生物信息學(xué)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已成為當(dāng)代預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的趨勢[25]。本研究通過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)烏骨綿羊PDGFRL 蛋白不存在跨膜區(qū)，是不屬于膜受體蛋白的親水性蛋白質(zhì)?？臻g結(jié)構(gòu)預(yù)測表明烏骨綿羊PDGFRL 蛋白主要由β折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，三級空間結(jié)構(gòu)表明其存在2 個功能結(jié)構(gòu)域，前人研究表明這2 個功能結(jié)構(gòu)域能有效抑制CT-26 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并發(fā)現(xiàn)PDGFRL 蛋白對某些細(xì)胞遷移有影響[26]。PDGFRL 蛋白的表達(dá)是否會對烏骨綿羊黑色素細(xì)胞的遷移和增殖產(chǎn)生影響還需更加深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，烏骨綿羊PDGFRL基因編碼區(qū)序列全長為1 128 bp，編碼375 個氨基酸，共發(fā)現(xiàn)G138A、T865C 和G893T 3 個同義突變位點；烏骨綿羊與普通綿羊PDGFRL基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性為99.73%；烏骨綿羊PDGFRL 蛋白是一種定位于細(xì)胞外的親水性分泌型蛋白，含有2 個功能結(jié)構(gòu)域。