馬鑫芮，冉雪琴，牛 熙，黃世會(huì)，王嘉福*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

睪丸是雄性哺乳動(dòng)物最重要的生殖器官，是精子發(fā)生和雄性激素產(chǎn)生的重要場(chǎng)所[1]。精子發(fā)生是在睪丸生精小管內(nèi)發(fā)生的一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分裂過(guò)程[2]，分為3 個(gè)階段：精原細(xì)胞有絲分裂形成精母細(xì)胞，減數(shù)分裂染色體數(shù)目減半生成精子，以及單倍體精子發(fā)育為成熟精子[2-3]，其中，減數(shù)分裂和單倍體階段是生殖細(xì)胞所特有的過(guò)程，由專門的基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制等方式進(jìn)行調(diào)控[4]。轉(zhuǎn)錄后抑制由調(diào)控元件與mRNA 的5'-UTR 區(qū)結(jié)合從而抑制基因的表達(dá)[4-5]，相關(guān)調(diào)控元件如小干擾RNA（siRNAs）、與Piwi 蛋白相互作用的RNA（piRNAs）和microRNAs（miRNAs）等是精子發(fā)生的重要調(diào)控機(jī)制[6-7]。

動(dòng)物Piwi 蛋白和piRNA 的主要功能是轉(zhuǎn)座子沉默，此外，越來(lái)越多的研究表明，二者還有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)的功能[8-15]。從進(jìn)化角度來(lái)看，piRNA 轉(zhuǎn)錄組具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，特別是因?yàn)閜iRNA 簇可以摻入到簇外的DNA 當(dāng)中，為新的反義piRNA 提供了底物[14]。在轉(zhuǎn)座子移動(dòng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)座子可以與piRNA 簇結(jié)合，piRNA 簇不能再與mRNA 相應(yīng)區(qū)段結(jié)合，從而解除了piRNA 簇對(duì)mRNA 的抑制作用。正常情況下，mRNA 經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)的DNA 整合到基因組中，并有可能摻入到piRNA簇中，實(shí)現(xiàn)piRNA 簇對(duì)該基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控[15]。與基因相關(guān)的piRNA 也可能來(lái)自具有編碼蛋白功能的編碼基因和piRNA 簇在反義鏈上的基因座[11]。

香豬是貴州本地的小型豬品種，是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也因?yàn)轶w型小、生理病理等與人類高度相似而成為重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和模式生物。香豬產(chǎn)仔數(shù)少但性成熟早，公豬3 月齡進(jìn)入青春期，6 月齡達(dá)到性成熟，但香豬性早熟的調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚。本文采用二代測(cè)序技術(shù)，研究香豬睪丸中piRNA 簇分布和表達(dá)規(guī)律，探索piRNA對(duì)睪丸發(fā)育和成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 本研究香豬樣品來(lái)自貴州大山地生態(tài)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。分別在2 月齡（斷奶期，M2）、3 月齡（初情期，M3）、6 月齡（性成熟期，M6）和12 月齡（體成熟期，M12）時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)收集睪丸樣品，每個(gè)發(fā)育期3 頭豬，用生理鹽水洗凈后剪切為小塊立即用液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 提取總RNA 采用Trizol 法從睪丸組織中分別提取總RNA（試劑盒來(lái)自天根生化科技有限公司），使用安捷倫2100 生物分析儀（美國(guó)安捷倫科技公司）評(píng)估總RNA 的數(shù)量和完整性。總RNA 儲(chǔ)存在-80℃用于后續(xù)分析。

1.3 小RNA 文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序 將相同發(fā)育期3頭香豬睪丸組織的總RNA 適度稀釋，等量混勻制成該發(fā)育期的混合樣品池[16]，按此方式共構(gòu)建了4 個(gè)小RNA 文庫(kù)。根據(jù)Ιllumina 樣品制備方案的程序和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小RNA 測(cè)序，從12.5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離15～44 nt 的小RNA 片段。隨后，用T4 RNA 連接酶將小RNA 分子的兩端加上接頭，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為cDNA。PCR 產(chǎn)物用QΙA quick PCR 純化試劑盒（德國(guó)Qiagen）純化，由華大基因研究中心有限公司（ВGΙ）測(cè)序。

1.4 piRNA 簇的篩選 測(cè)定的原始序列經(jīng)質(zhì)控過(guò)濾得到clean reads，使用Вowite 將clean data 映射到豬參考基因組上（Sus scrofa11.1），保留完全匹配的序列做進(jìn)一步分析。通過(guò)本地比對(duì)軟件（ncbi-blast-2.7.1+-win64）將 待 分 析 數(shù) 據(jù) 與piRВase（http：//www.regulatoryrna.org/database/piRNA/index.Html）中 豬 的piRNA 序 列以及豬ncRNA、cDNA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出各發(fā)育期候選piRNA 序列。將至少10 個(gè)piRNAs 位于同一條染色體上且間距不超過(guò)5 000 nt 的多個(gè)piRNA 定義為一個(gè)piRNA 簇[17]。根據(jù)前面piRNA 的分析，piRNA 簇的表達(dá)量（標(biāo)準(zhǔn)化之后的CPM 值）為簇內(nèi)各個(gè)piRNA 序列表達(dá)量之和。

1.5 piRNA 簇的生物信息學(xué)分析 用KOВAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1）對(duì)與piRNA 簇互補(bǔ)的mRNA 進(jìn)行GO 分類和路徑注釋，再進(jìn)行路徑分析。用ENSEMВL 中的VEP（http：//asia.ensembl.org/Tools/VEP）進(jìn)行基因注釋，用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）做基因在染色體上的定位圖。用R 包的edgeR 軟 件（http：//bioconductor.org/biocLite.R）采 用兩兩比較的方法分析靶基因的表達(dá)量差異，差異表達(dá)的閾值為P＜0.05 且log FC >1 或log FC＜-1。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育期香豬睪丸piRNA 簇的篩選及分布 本研究從2 月齡中篩選出228 個(gè)piRNA 簇，3 月齡中篩選出179 個(gè)piRNA 簇，6 月齡中篩選出187 個(gè)簇，12 月齡中篩選出164 個(gè)簇。這些piRNA 簇在基因組中分布不均，除了4 個(gè)發(fā)育期的Y 染色體以及3 月齡的18 號(hào)染色體、X 染色體外，幾乎在每個(gè)染色體上都有分布，在4 個(gè)發(fā)育期中6 號(hào)染色體、7 號(hào)染色體上piRNA 簇均分布最多（圖1）。

2.2 piRNA 簇在4 個(gè)發(fā)育期的來(lái)源分析 基于piRNA簇內(nèi)各條piRNA 序列的來(lái)源以及該簇在染色體上的起始位置，將這些簇分別與cDNA、ncRNA、轉(zhuǎn)座子進(jìn)行比對(duì)，piRNA 簇明顯富集于轉(zhuǎn)座子，但是piRNA 簇內(nèi)的轉(zhuǎn)座子來(lái)源piRNA 數(shù)量隨著月齡的增加顯著減少（M2：61%，M3：55%，M6：48%，M12：38%），ncRNA 和基因衍生的piRNA 簇在每個(gè)發(fā)育期保持在87%左右。此外，統(tǒng)計(jì)基因來(lái)源的piRNA 簇?cái)?shù)量，每個(gè)文庫(kù)檢測(cè)到的piRNA 簇中71.6%～76.3%是來(lái)自基因序列，包括與基因序列一樣和反向互補(bǔ)2 種類型，與基因序列一致和與基因序列反向互補(bǔ)的piRNA 簇?cái)?shù)量相近。與基因序列一致的區(qū)域可能是piRNA 簇的產(chǎn)生區(qū)域；與piRNA 簇反向互補(bǔ)的基因序列，可能是piRNA簇作用的靶位點(diǎn)。

2.3 簇內(nèi)區(qū)域piRNA 序列重疊現(xiàn)象分析 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析表明，存在多個(gè)piRNAs 序列重疊現(xiàn)象（圖2）。1 號(hào)染色體120 473 959～120 473 989 的35 nt區(qū)域與12 個(gè)piRNAs 序列一樣，長(zhǎng)度為29～32 nt。3號(hào) 染 色 體59 160 114～59 160 144 的31 nt 區(qū) 域 與3 個(gè)piRNA 序列一樣，長(zhǎng)度為29～31 nt。

2.4 共表達(dá)piRNA 簇表達(dá)量及其基因富集分析 從4 個(gè)發(fā)育期中共篩選出758 個(gè)piRNA 簇，從中篩出198 個(gè)2 個(gè)及2 個(gè)以上月齡共表達(dá)的piRNA 簇（表1），其中僅在2 月齡和3 月齡表達(dá)的有25 個(gè)piRNA 簇，僅在2月齡和6 月齡表達(dá)的有9 個(gè)簇，只在2 月齡和12 月齡表達(dá)的有3 個(gè)簇，只在3 月齡和6 月齡表達(dá)的有6 個(gè)簇，有1 個(gè)共表達(dá)簇僅存在于3 月齡和12 月齡，有15個(gè)共表達(dá)簇僅存在于6 月齡和12 月齡，在4 個(gè)月齡中都表達(dá)的有107 個(gè)piRNA 簇（圖3）。整體來(lái)看，僅在2 月齡和3 月齡中表達(dá)的piRNA 簇最多，結(jié)合前文分析，2 月齡和3 月齡之間的差異最小，可以歸為一組（性成熟前期）。對(duì)4 個(gè)發(fā)育期的piRNA 簇進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)量分析如圖4 所示，4 個(gè)發(fā)育階段香豬睪丸中piRNA 簇的表達(dá)豐度差異不太明顯，4 個(gè)樣本香豬睪丸中超過(guò)58% 的簇均處于低豐度（CPM＜1），但是4 個(gè)發(fā)育期簇高豐度比例隨著月齡的增加也略微有所增加（CPM>15）。

表1 2個(gè)及2 個(gè)以上月齡共表達(dá)的piRNA 簇

在2 個(gè)及2 個(gè)以上月齡共表達(dá)的198 個(gè)piRNA 簇中有117 個(gè)piRNA 簇來(lái)源于基因，對(duì)其在染色體上進(jìn)行定位（圖5）。其中3 號(hào)、6 號(hào)、7 號(hào)、14 號(hào)染色體上富集的基因相對(duì)較豐富。對(duì)piRNA clusters 來(lái)源基因進(jìn)行GO 富集分析，主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括Celluar Process（細(xì)胞過(guò)程）、Single-Organism Process（單一生物過(guò)程）、Metabolic Process（代謝過(guò)程）、Вiological Regulation（生物調(diào)控）等；piRNA 簇的來(lái)源基因主要分布于Cell（細(xì)胞）、Cell Part（細(xì)胞部分）、Organelle（細(xì)胞器）、Organelle Part（細(xì)胞器部分）等位置；分子功能主要涉及Вinding（結(jié)合）、Catalytic Activity（催化活性）等（圖6）。對(duì)其來(lái)源基因進(jìn)行KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)了2 條與睪丸發(fā)育相關(guān)的的通路，即軸突傳導(dǎo)通路和MAPK 信號(hào)通路。

piRNA 簇互補(bǔ)的mRNA 編碼的基因視為piRNA 簇作用的靶位點(diǎn)。把2 月齡和3 月齡piRNA 簇歸為一組（性成熟前期）分別與6 月齡、12 月齡采用兩兩比較的方法對(duì)其靶基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析（表2），Clu-002（CYP19A1，cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1）在2 月齡和3 月齡差異分析中顯著上調(diào)，在性成熟前期和6 月齡，性成熟前期和12 月齡的差異分析中均為下調(diào)；Clu-031（ΙFT22，Ιntraflagellar Transport 22）在性成熟前期和6 月齡差異分析中表達(dá)上調(diào)；Clu-192（CCNO，cyclin O）在性成熟前期和6月齡，性成熟前期和12 月齡的差異分析中均為顯著下調(diào)；Clu-116（WDR1，WD repeat domain 1）在性成熟前期和12 月齡的差異分析中表達(dá)下調(diào)。

3 討論

果蠅和小鼠等模式生物的研究，對(duì)于Piwi/piRNA途徑的功能和分子機(jī)制具有重要意義[18]。然而，這些模式生物不能反映包括人類在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動(dòng)物的Piwi 旁系同源物[19]。在這方面，具有3 個(gè)完整哺乳動(dòng)物Piwi 旁系同源物的豬和人類更接近。此外，高質(zhì)量豬基因組的可用性以及對(duì)豬TEs 的徹底注釋和強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具[20-21]使豬成為研究Piwi/piRNA 的合適模型。

3.1 香豬睪丸piRNA 簇的分布及來(lái)源 piRNA 簇在染色體上的分布是不均勻的，在6、7、14 號(hào)染色體上呈高豐度富集，其密度分別為0.15 個(gè)/Mb、0.21 個(gè)/Mb、0.20個(gè)/Mb。在豬的1 號(hào)染色體最長(zhǎng)，18 號(hào)染色體最短，而豬Piwil1和Piwil2由14 號(hào)染色體編碼，Piwil4位于9 號(hào)染色體上，說(shuō)明piRNA 簇的分布與染色體的長(zhǎng)度無(wú)關(guān)，可能與Piwi 蛋白的分布有關(guān)[17]。

本研究分析的piRNA 簇是從不同月齡的整個(gè)睪丸中分離出來(lái)，因此代表了來(lái)自不同發(fā)育期生殖細(xì)胞階段的piRNA 的混合物。隨著月齡的增加TE 衍生相關(guān)簇所占比例相對(duì)減少，這與小鼠模型的研究結(jié)果一致，性成熟前生殖細(xì)胞進(jìn)行活躍的減數(shù)分裂，即只有減數(shù)分裂表達(dá)的piRNA 富含TE 相關(guān)序列，并參與乒乓循環(huán)，以抑制TEs 在精子發(fā)生中的去甲基化和重甲基化過(guò)程的活躍度[22-23]。本研究中還發(fā)現(xiàn)了極少的假基因衍生簇，在普通絨猴睪丸中表達(dá)的piRNA 的分析表明，假基因位于piRNA 簇中，并且在piRNA 簇相反的方向[24]，說(shuō)明包含基因或假基因序列的piRNA 簇的存在不是豬特有的，可能是普遍現(xiàn)象。

表2 差異簇靶基因數(shù)量表

3.2 香豬睪丸piRNA 簇來(lái)源基因分析 在精子發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞的數(shù)目、形態(tài)特征及細(xì)胞類型都會(huì)發(fā)生顯著變化，這些過(guò)程均與細(xì)胞代謝密切相關(guān)。對(duì)piRNA簇來(lái)源基因進(jìn)行GO 富集和KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)piRNA 簇的來(lái)源基因與細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)代謝，如核酸及氨基酸代謝有關(guān)。其中簇Clu-003（PAK6，p21 (RAC1)activated kinase 6）、簇Clu-033（HSPВ1，heat shock protein family В (small) member 1）和簇Clu-025（ECSΙT，ECSΙT signalling integrator）分別富集到與繁殖發(fā)育相關(guān)的軸突導(dǎo)向、MAPK 信號(hào)通路[25]。研究表明，GnRH可以經(jīng)MAPK 信號(hào)通路調(diào)控大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)睪酮的分泌[26]。在本研究中簇Clu-032（HSPВ1）在6 月齡（性成熟期）中的表達(dá)量是最高的，HSPВ1 通過(guò) 調(diào) 控MAPK6/MAPK4 信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK家族信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)等影響MAPK 信號(hào)通路，從而影響香豬精子生成過(guò)程，提高香豬繁殖發(fā)育性能。簇Clu-003 的來(lái)源基因PAK6為編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，這些激酶在細(xì)胞增殖[27]、細(xì)胞凋亡[28]等細(xì)胞過(guò)程中起作用，其編碼的蛋白質(zhì)與雄激素受體（AR）相互作用，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而且該基因表達(dá)異?？梢鹎傲邢侔┌Y[29]，有結(jié)果表明miR-26a 通過(guò)靶向PAK6基因抑制豬支持細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡，PAK6基因可能是豬精子發(fā)生的調(diào)節(jié)因子[30]。

本文對(duì)4 個(gè)發(fā)育期的piRNA 簇的靶基因進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)影響睪丸發(fā)育、精子發(fā)生的共表達(dá) 簇 靶 基 因（CYP19A1、CCNO）。CYP19A1是 一種將類固醇激素從睪酮轉(zhuǎn)化為雌激素的酶[31]，精漿中類固醇激素的平衡對(duì)精子的生育能力很重要[32]。在豬中，CYP19A1定位于精子近端和遠(yuǎn)端尾部[33]，并產(chǎn)生雌激素[34]，誘導(dǎo)精子中雌激素受體途徑的下游反應(yīng)，但過(guò)量的雌激素也會(huì)降低精子的生育能力[35]。對(duì)人和牛的精子研究表明，一些轉(zhuǎn)錄物（包括ADAM2和CYP19）的表達(dá)量影響精子的生育能力[36]。在本研究中CYP19A1（Clu-20）在2 月齡和3 月齡差異分析中顯著上調(diào)，在性成熟前期和6 月齡，性成熟前期和12月齡的差異分析中均為下調(diào)，由此推測(cè)在斷奶期到初情期精子的生育能力是逐漸上升的，性成熟期及體成熟期的精子生育能力較初情期弱。最近，在一組原發(fā)性睫狀體運(yùn)動(dòng)障礙（PCD）患者中發(fā)現(xiàn)了CCNO突變，出現(xiàn)支氣管擴(kuò)張和呼吸窘迫綜合征，以及腦積水（約10%）和生育能力下降[37]。這和小鼠的研究結(jié)果是一樣的，在CCNO缺乏的小鼠中，表現(xiàn)出額外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，高度滲透性的腦積水以及雄性和雌性不育和生長(zhǎng)遲緩[38]。

4 結(jié)論

本研究對(duì)斷奶期（2 月齡）、初情期（3 月齡）、青春期（6 月齡）以及性成熟期（12 月齡）香豬睪丸組織中的小RNA 進(jìn)行高通量測(cè)序，共得到758 個(gè)piRNA 簇，其中有198 個(gè)簇為2 個(gè)及2 個(gè)以上發(fā)育期共表達(dá)的，其余均為各個(gè)發(fā)育期特有簇。通過(guò)GO 和KEGG 通路分析，初步找到了3 個(gè)與繁殖發(fā)育有關(guān)的簇Clu-003（PAK6）、Clu-033（HSPВ1） 和Clu-025（ECSΙT）以及2 個(gè)與精子發(fā)生有關(guān)的差異共表達(dá)簇靶基因（CYP19A1、CCNO），證明了piRNA 簇在睪丸發(fā)育過(guò)程中起作用。