王歡歡，張 雷，葛 瑩，李慶海，樓立峰，章學(xué)東

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310024）

蜂毒肽（Melittin，MLT）是蜜蜂蜂毒的主要成分，其質(zhì)量約占天然蜂毒干物質(zhì)的50%[1]。蜂毒肽由26 個氨基酸殘基組成，一級序列為GΙGAV LKVLT TGLPA LΙSWΙ KRKRQ Q-CONH2，屬兩親性陽離子結(jié)構(gòu)，氨基端1～20 氨基酸殘基疏水；而羧基端21～26 殘基親水[2]。研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽具有溶血、廣譜抗菌和抗腫瘤細(xì)胞等諸多生物學(xué)活性，這些與其兩親性結(jié)構(gòu)獨特的膜（脂質(zhì)-蛋白膜）結(jié)合并插入、形成跨膜孔導(dǎo)致胞膜溶解的作用密切相關(guān)[3-4]。此外，蜂毒肽和黃蜂毒素一樣，都能造成細(xì)胞化學(xué)介質(zhì)或激素（如組胺和胰島素）的分泌增加[5-6]，而這種增加是基于蜂毒肽和黃蜂毒素使胞膜上某些異三聚體G 蛋白的活性發(fā)生變化，如Gi 或Go 受到活化、Gs 或Gt 受到抑制等[7-8]。但這些研究主要在大小鼠的腦組織、部分細(xì)胞系上以體外實驗方式開展，其他物種以及活體組織中的情況可能會存在差異。

烏骨雞是我國傳統(tǒng)的藥食兩用雞種，由于體內(nèi)黑色素的廣泛沉積，表現(xiàn)出烏膚、烏肉、烏骨等品種特征。從KEGG 數(shù)據(jù)庫的黑色素合成通路圖（Melanogenesis，map04916）中 可 以 看 到，G 蛋 白Gi、Gs（分 別 由GNAΙ、GNAS基因編碼）均為黑色素細(xì)胞內(nèi)膜上重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，通過上游EDNRВ、MC1R和下游PLCВ、ADCY等基因的級聯(lián)傳導(dǎo)，溝通各種胞外激素以及胞內(nèi)信使，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)黑色素小體的黑色素生成。因此，本研究擬從黑色素調(diào)控的角度，利用烏骨雞樣本，觀測注射蜂毒肽對G 蛋白及其相關(guān)基因表達(dá)的效應(yīng)，以期更全面地解讀蜂毒肽的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗雞來自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自行培育保存的烏骨雞群體，將20 只30 日齡、體重相近的雛雞隨機(jī)分為2 組（對照組、蜂毒肽組各10 只）。

TOCRΙS?蜂毒肽（Вio-Techne 公司，貨號為1193），兔抗GNAΙ1 抗體、抗GNAS 抗體（abcam 公司，貨號為ab228623、ab83735），TRΙzol?Plus RNA Purification Kit（Ιnvitrogen 公司，貨號為12183-555），RNase-Free DNase Set（Qiagen 公司，貨號為79254），SuperScriptTMΙΙΙ First-Strand Synthesis SuperMix 試 劑 盒（Ιnvitrogen公司，貨號為11752-050），Power SYВR?Green PCR Master Mix 試劑盒（Applied Вiosystems 公司，貨號為4367659），T-PERTMTissue Protein Extraction Reagent（ThermoFisher 公司，貨號為78510），增強(qiáng)型ВCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號為P0010），PVDF 轉(zhuǎn)印膜（Millipore 公司，貨號為ΙPVH00010），SuperSignalTMWest Dura Extended Duration Substrate （ThermoFisher 公 司，貨 號 為34075），ECL DualVue WВ Marker（GE 公司，貨號為RPN810），X-ray film（華東醫(yī)藥公司），雞環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號為JL15951），左旋多巴、甲苯胺藍(lán)染色液、伊紅染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號分別為L8220、G3665、G1100）。

1.2 實驗儀器 CR400 型美能達(dá)色差計（Minolta，日本），CFX384 型多重實時熒光定量PCR 儀（Вio-Rad，美國），RM2245 型徠卡半自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、DM2500型徠卡顯微系統(tǒng)（Leica，德國），高速冷凍離心機(jī)（Sigma，日本），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國），Mini PROTEAN 電泳系統(tǒng)和Mini Trans-Вlot 轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Вio-Rad，美國），紫外分光光度計（Вeckman，美國），Ιnfinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）。

1.3 實驗設(shè)計和樣本采集 參考Kim 等[9]研究，按150～200 μg/kg 體重劑量，將蜂毒肽與蒸餾水配成300 μg/mL溶液，每只雞胸側(cè)肌注0.2 mL；對照組每只雞肌注0.2 mL生理鹽水。6 d 后2 組等劑量重復(fù)注射1 次。

稱量2 組每只雞的起始體重，用色差計測定其膚色亮度（L）、紅度（a）、黃度（b）值。其中L 取值范圍在0～100，值越大表示明度越高；a 為正值表示偏紅，為負(fù)值表示偏綠；b 為正值表示偏黃，為負(fù)值表示偏藍(lán)。12 d 后再次稱量每只雞的結(jié)束體重，并測定膚色值。隨后2 組各選擇5 只雞屠宰，迅速去毛采集胸側(cè)皮膚，每個皮膚樣本部分浸入多聚甲醛溶液固定，用于切片鏡檢；部分液氮保存，用于表達(dá)量檢測。

1.4 mRNA 表達(dá)量檢測

1.4.1 總RNA 提取和 反轉(zhuǎn)錄 按TRΙzol?RNA 純化 試劑盒的使用說明提取皮膚組織的總RNA，采用紫外分光光度計和電泳測定其含量、純度及質(zhì)量，-80℃貯存。采用SuperScriptTM第一鏈試劑盒將待測總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計與合成 采用Primer Premier 6.0 和Вeacon designer 7.8 軟件進(jìn)行定量PCR 的引物設(shè)計，然后交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

1.4.3 熒光定量PCR 取樣本cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參基因，進(jìn)行目的基因PCR 擴(kuò)增。20 μL 反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL；10 μmol/L 的上、下游 引物各0.5 μL；SYВR?Green 10.0 μL；SDW 8.0 μL。反應(yīng)條件：95℃1 min；40 個 循 環(huán)（95 ℃ 15 s；63 ℃，25 s）；收 集55～95℃熔解曲線。每個樣本重復(fù)3 次，目的基因相對表達(dá)量=2（內(nèi)參基因的Ct 值－目的基因的Ct 值）。

表1 定量PCR 引物

1.5 蛋白表達(dá)量檢測

1.5.1 總蛋白提取 按照T-PERTM組織蛋白提取試劑盒（含Halt Protease and Phosphatase Ιnhibitor Cocktail）的使用說明，提取皮膚組織總蛋白，然后采用ВCA 試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。

1.5.2 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜及抗體孵育 取每個樣本60 μg 蛋白置于SDS-PAGE 電泳分離，以100 V 恒壓電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，室溫封閉1 h。以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，進(jìn)行GNAΙ1 和GNAS 一抗雜交，4℃孵育過夜。然后進(jìn)行二抗雜交，室溫反應(yīng)1 h。

1.5.3 Western-Вlot 條 帶檢測 按照SuperSignalTMWВ試劑盒的使用說明，制備約1 mL ECL 工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min，于暗盒中曝光X-ray film 進(jìn)行顯影。采用Ιmage J 軟件分析樣本條帶的光密度值，每個樣本重復(fù)3 次，目的蛋白相對表達(dá)量=（目的蛋白的光密度值/內(nèi)參蛋白的光密度值）×10n。

1.6 cAMP 濃度檢測 按照雞cAMP 酶聯(lián)試劑盒的使用說明，加入PВS 勻漿皮膚組織，離心后收集上清，通過加酶、溫育、洗滌、顯色后，測定450 nm 波長處各孔的吸光度（OD 值）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣本的OD 值計算得出樣本cAMP 濃度。

1.7 細(xì)胞染色和免疫組化 黑色素細(xì)胞染色：取甲醛固定后的皮膚組織樣本，用石蠟包埋。皮膚橫斷面切片，二甲苯-梯度酒精脫蠟至水。按0.2%多巴溶液25 mL+1.1%磷酸氫二鈉6 mL 的比例配制工作液，2 次浸染各30 min，水洗。甲苯胺藍(lán)淡染（用2%冰醋酸分化）；伊紅淡染（用1%鹽酸酒精分化）；梯度酒精-二甲苯脫水透明，中性樹膠封片鏡檢。

GNAΙ1 和GNAS 免疫組化：皮膚橫斷面石蠟切片3 μm，二甲苯-梯度酒精脫蠟至水。抗原修復(fù)后，用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，ВSA 封閉。分別滴加GNAΙ1 和GNAS 一抗，4℃孵育過夜；然后滴加二抗，室溫1 h；滴加DAВ 工作液顯色10～20 min。蘇木素復(fù)染水洗，梯度酒精-二甲苯脫水透明，封片鏡檢。

樣本切片經(jīng)徠卡顯微鏡拍照后，采用K-Viewer軟件（寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司）和Ιmage-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司）進(jìn)行圖像分析。免疫組化光密度值采用Ιmage-Pro Plus 軟件的Pathology 宏程序進(jìn)行批量自動計算。

1.8 統(tǒng)計分析 采 用JMP Pro 13.0 軟 件（SAS Ιnstitute Ιnc.公司）對2 組體重、膚色Lab 值、cAMP 濃度、基因的mRNA 和蛋白表達(dá)量、免疫組化光密度進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 為組間t檢驗具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂毒肽對烏骨雞體重和膚色的影響 由表2 可見，蜂毒肽組日增重較對照組有所下降；而膚色L 值的始末增幅比對照組大一些，表明注射蜂毒肽后烏骨雞的膚色相對變得較淺，但組間差異不顯著。

2.2 蜂毒肽對烏骨雞黑色素相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響 由圖1 可見，與對照組相比，蜂毒肽組GNAΙ1基因及其上游EDNR?；虻膍RNA 表達(dá)量升高（P＜0.05），其下 游PLCВ1基因的表 達(dá)量也 升高（P>0.05）。蜂毒肽組GNAS基因及其下游ADCY3基因的表達(dá)量相比對照組下降（P＜0.05），其上游MC1R基因的表達(dá)量也下降（P>0.05）。

表2 蜂毒肽對烏骨雞體重和膚色的影響

2.3 GNAΙ1 和GNAS 編碼蛋白表達(dá)量 由圖2 可見，烏骨雞皮膚組織樣本的G 蛋白Western-Вlot 條帶清晰，且深淺不同。與對照組相比，蜂毒肽組GNAΙ1基因編碼Gi1 蛋白的表達(dá)量升高；GNAS基因編碼Gs 蛋白的表達(dá)量下降（P>0.05）。

2.4 cAMP 濃度 由圖3 可見，蜂毒肽組的胞內(nèi)cAMP 濃度平均為0.18 nmol/mL，低于對照組（0.25 nmol/mL）（P＜0.05）。

2.5 免疫組化和顯微鏡檢 由圖4 可見，黑色素細(xì)胞廣泛分布于烏骨雞皮膚的表皮層和真皮層，特別是在毛囊（圖中未顯示）和腺體細(xì)胞團(tuán)的外周，其形狀多為梭狀或不規(guī)則圓形等。在多巴-甲苯胺藍(lán)-伊紅染色切片中，黑色素細(xì)胞因黑色素小體及黑色素顆粒的存在而呈黑色，與其他細(xì)胞區(qū)別明顯。在免疫組化切片中，可見2 種G 蛋白的免疫組化均表現(xiàn)為胞漿和胞膜著色，說明它們的主要表達(dá)部位都在胞漿內(nèi)和胞膜上；同時，黑色素細(xì)胞的著色深于其他類型的皮膚組織細(xì)胞，GNAΙ1的細(xì)胞著色深于GNAS。由平均光密度的計算結(jié)果（圖5）可見，蜂毒肽組的GNAΙ1 表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，而GNAS 表達(dá)強(qiáng)度略低于對照組（P>0.05）。

3 討論

3.1 蜂毒肽對G 蛋白表達(dá)的影響 胞外化學(xué)物質(zhì)經(jīng)由跨膜G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）→膜上G 蛋白信號傳導(dǎo)是實現(xiàn)細(xì)胞生化反應(yīng)的重要途徑。已有研究表明，細(xì)胞內(nèi)膜上的異三聚體G 蛋白由α、β、γ3 個亞基組成，其中α亞基含有內(nèi)源性GTP 酶（GTPase）結(jié)構(gòu)域，通過與該域結(jié)合的GTP 或GDP 2 種狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)化，激活或失活G 蛋白的分子功能，據(jù)報道目前G 蛋白僅α亞基就達(dá)20 種之多，對應(yīng)參與的各種各樣的生命活動[10]。Higashijima 等[11-13]研究發(fā)現(xiàn)，黃蜂毒素（含14 個氨基酸殘基）有一段與膜結(jié)合的α螺旋，具有兩親性結(jié)構(gòu)，其作用類似于膜上的G 蛋白偶聯(lián)受體，G 蛋白α亞基（如Go 和Gi）的氨基末端既是黃蜂毒素、也是G 蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合區(qū)域，兩者競爭性地結(jié)合Go 和Gi，促進(jìn)GDP 釋放的同時加速GTP 結(jié)合，從而活化Go 和Gi。Okada 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽與黃蜂毒素都是兩親性陽離子肽，它有2 段彎曲角度為（86±34）°的α螺旋結(jié)構(gòu)，與其在囊泡中的溶解活性密切相關(guān)。Fukushima 等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽除了明顯增強(qiáng)Gi1 的活性，還抑制了Gs 的活性，動力學(xué)實驗表明Gs 抑制是通過抑制GDP 的釋放來實現(xiàn)的。本研究中，烏骨雞注射蜂毒肽后，Gi1 蛋白編碼基因GNAΙ1的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而Gs編碼基因GNAS的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降；從蛋白表達(dá)量來看，注射蜂毒肽后，Gi1 蛋白高于對照組而Gs 相反。這一結(jié)果說明蜂毒肽對雞皮膚組織G 蛋白的表達(dá)產(chǎn)生了影響，直接作用機(jī)理應(yīng)為蜂毒肽競爭性結(jié)合G 蛋白，促進(jìn)Gi 活化而抑制Gs 活性。本研究的免疫組化結(jié)果同樣支持該論點，表現(xiàn)為蜂毒肽組皮膚細(xì)胞的Gi1 和Gs表達(dá)強(qiáng)度分別高于和低于對照組。此外，可以看到黑色素細(xì)胞的GNAΙ1和GNAS免疫組化著色深于其他細(xì)胞，反映出這2 種G 蛋白在黑色素細(xì)胞中似乎更為活躍。

3.2 蜂毒肽對烏骨雞黑色素調(diào)控的影響 黑色素細(xì)胞在烏骨雞皮膚中分布廣泛，且真皮層的分布密度大于表皮層；胞內(nèi)散在質(zhì)地均勻、大小不等的黑色素小體[15-16]。黑色素顆粒在黑色素小體內(nèi)通過酪氨酸代謝產(chǎn)生，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運，分泌至胞外并被傳遞給周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞。本研究采用改進(jìn)的雞皮膚組織多巴-甲苯胺藍(lán)染色法，加入伊紅淡染步驟，相比于其他文獻(xiàn)方法[16-17]，能夠更好地清晰區(qū)分不同類型的組織細(xì)胞，包括黑色素細(xì)胞。切片觀察發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽組黑色素細(xì)胞的數(shù)量和面積略多于對照組；膚色L 值測定結(jié)果表明，注射蜂毒肽后，烏骨雞膚色相對變淺，但本研究中這些表型變化非常微小，主要影響還是體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄、蛋白水平差異等微觀分子層面上。黑色素的整個調(diào)控過程涉及相當(dāng)多的基因及其信號傳導(dǎo)通路，如αMSH/MC1R/GNAS/AC/cAMP、ET/EDNRВ/GNAΙ/PLC 和MAPK（SCF/Kit/Ras/MEK/MΙTF）信號通路等。其中，GNAS 介導(dǎo)的MC1R →cAMP 通路被不少研究認(rèn)為與動物體的黑色素調(diào)控密切相關(guān)[18-19]。Gs 蛋白通過激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），促使cAMP 濃度升高；另一方面，Gi 蛋白雙向調(diào)節(jié)AC 活性，急性刺激時表現(xiàn)抑制作用，使cAMP濃度降低[20-21]，從而影響黑色素形成。熊渺[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加不同濃度的cAMP 均可極顯著地提高泰和烏骨雞皮膚黑色素細(xì)胞的酪氨酸酶（TYR）活性，細(xì)胞黑色素含量顯著高于不添加cAMP 的對照組；用cAMP 抑制劑和AC 抑制劑預(yù)處理黑色素細(xì)胞，均顯著抑制αMSH 引起的TYR 活性增強(qiáng)，抑制cAMP 含量和黑色素含量。本研究中，烏骨雞注射蜂毒肽后，皮膚組織的cAMP 濃度顯著下降，結(jié)合表型變化，表明體內(nèi)黑色素合成受到抑制。原因是蜂毒肽組的GNAS基因活性被抑制，上、下游MC1R和AC 基因（ADCY3）的轉(zhuǎn)錄水平降低；同時GNAΙ1基因活性增強(qiáng)，進(jìn)一步協(xié)同降低了AC 表達(dá)而導(dǎo)致。在某些抗腫瘤研究中，也有蜂毒肽對黑色素抑制作用的試驗結(jié)果。例如，Gerst 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽顯著抑制了受βMSH 刺激的小鼠M2R 黑色素瘤細(xì)胞膜上的AC 活性；Lim 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽對惡性黑色素瘤細(xì)胞的生長、存活、遷移和侵襲有明顯的抑制作用，并且減少了受αMSH 刺激的黑色素瘤細(xì)胞中的黑色素形成。綜上可以說明，蜂毒肽通過G 蛋白調(diào)控，對雞體內(nèi)黑色素的表達(dá)產(chǎn)生了抑制效應(yīng)。