霍子?xùn)|，高廣亮，張克山，王啟貴，趙獻(xiàn)芝*

（1.甘肅省畜牧技術(shù)推廣總站，甘肅蘭州 730030；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；3.重慶市肉鵝遺傳改良工程技術(shù)研究中心，重慶 402460）

鵝作為重要水禽之一，具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性好、耐粗飼、抗病性強(qiáng)和耐粗飼等特點(diǎn)，為廣大消費(fèi)者提供肉、蛋、羽絨、肥肝等。體組成和蛋品質(zhì)性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，也是復(fù)雜的數(shù)量性狀，且均受到遺傳、營(yíng)養(yǎng)、飼養(yǎng)方式、外界環(huán)境等影響[1-3]。利用生物學(xué)等方法進(jìn)行研究，鴨體尺、雞蛋殼顏色等分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)及廣泛應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助選擇，極大地推進(jìn)了禽類的體組成和蛋品質(zhì)等方面的研究進(jìn)展[4-6]。

促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing Hormone，GnRH）是動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸中關(guān)鍵的信號(hào)分子，下丘腦根據(jù)光照變化等外界環(huán)境的刺激調(diào)節(jié)促卵泡素（Follicle-stimulating Hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）、睪酮（Testosterone，T）或雌二醇（Estrogen，E2）等重要激素分泌[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，GnRH 廣泛分布于各個(gè)物種的生殖、神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，它可以傳遞信息，從而協(xié)調(diào)整個(gè)系統(tǒng)[9-10]。GnRH 濃度和基因表達(dá)量隨著繁殖周期的變化而變化[11]。GnRH基因與哺乳動(dòng)物的繁殖、生長(zhǎng)及豬和羊的體組成和生長(zhǎng)性狀相關(guān)[12-14]；此外，GnRH基因SNP 位點(diǎn)與禽類的產(chǎn)蛋量、蛋品質(zhì)等性狀顯著或極顯著相關(guān)[15-16]，與鵝的產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重等性狀顯著或極顯著相關(guān)[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，鵝GnRH基因包含完整的4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，92 個(gè)氨基酸序列，檢測(cè)到46 個(gè)SNP 位點(diǎn)，并在四川白鵝群體（群體大小為217只）中發(fā)現(xiàn)GnRH基因是鵝產(chǎn)蛋性狀的重要候選基因[17]。本研究以另外一個(gè)四川白鵝群體為實(shí)驗(yàn)材料，利用直接測(cè)序的方法對(duì)該基因的46 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并進(jìn)行單位點(diǎn)和單倍型與鵝的體組成和蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，鑒定GnRH基因顯著影響鵝的體組成和蛋品質(zhì)的分子標(biāo)記，為鵝的分子選擇育種提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和數(shù)據(jù)采集 本研究以重慶市榮昌區(qū)安富水禽實(shí)驗(yàn)基地的208 只四川白鵝（母鵝）群體為實(shí)驗(yàn)材料。為準(zhǔn)確記錄鵝蛋品質(zhì)性狀，每只鵝從出雛后進(jìn)行系統(tǒng)的腳號(hào)和翅號(hào)標(biāo)記，20 周齡時(shí)利用含有肝素鈉的真空采血管翅靜脈采血2 mL，利用血液基因組提取試劑盒（北京天根公司，DP332）提取血液基因組DNA，并將其溶解在TE 溶液中，在-20℃保存?zhèn)溆?。上述四川白鵝孵化出殼后稱量記錄鵝初生重，飼養(yǎng)至28 周齡，每個(gè)個(gè)體轉(zhuǎn)移到個(gè)體籠（600 mm×800 mm×900 mm）中飼養(yǎng)至65 周（休產(chǎn)期），并自由飲水和飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料。根據(jù)組成性狀的測(cè)量方法[19]，利用軟尺測(cè)量成年鵝的頸長(zhǎng)、胸寬、半潛水長(zhǎng)、骨盆寬、體斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、龍骨長(zhǎng)和脛圍等；在鵝產(chǎn)蛋高峰期（40 周齡），采集208 只鵝連續(xù)產(chǎn)的3 個(gè)鵝蛋，利用電子天平稱量蛋殼重、蛋黃重；根據(jù)《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語(yǔ)和度量統(tǒng)計(jì)方法》（NY/T 823-2004）測(cè)定，采用NaCl 溶液漂浮法測(cè)定蛋比重，設(shè)置9 個(gè)梯度的濃度（1.068、1.072、1.076、1.086、1.092、1.096、1.100 g/cm3）；利用游標(biāo)卡尺測(cè)量蛋殼的鈍部、尖部和中間部位，并取三者的平均值計(jì)算蛋殼厚度；利用游標(biāo)卡尺檢測(cè)蛋長(zhǎng)直徑和短徑，并計(jì)算蛋形指數(shù)；利用羅氏比色卡進(jìn)行蛋黃顏色的測(cè)定；蛋殼強(qiáng)度利用蛋殼測(cè)力計(jì)（EFG-0502，Robotmation 公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 SNP 多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)和分型 為進(jìn)一步研究GnRH基因與鵝其他性狀的相關(guān)性，本研究以四川白鵝的基因組DNA 為模板，利用前期研究中的PCR 引物[17]和直接測(cè)序法對(duì)GnRH基因的SNP 多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和基因分型。PCR 擴(kuò)增體系50 μL：基因組DNA（＜1 μg）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Gflex PCR Вuffer 25 μL，Tks Gflex DNA 聚 合 酶1 μL，雙 蒸水21 μL。PCR 擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2 min，30 個(gè)循環(huán)（98℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸60 s），72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物鑒定正確后送Ιnvitrogen 公司測(cè)序，用DNAStar 軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析。通過(guò)與前期的GnRH基因序列比對(duì)確定SNP 基因型[17]。參照命名系統(tǒng)（www.hgvs.org/mutnomen）對(duì)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一命名。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 針對(duì)上述GnRH基因的46 個(gè)SNP 位點(diǎn)，用JMP14.0 軟件（SAS institute Japan,Minato-ku，Japan）通過(guò)滑動(dòng)窗口方法構(gòu)建單倍型，每3 個(gè)SNPs 構(gòu)成1 個(gè)窗口，每次向前滑動(dòng)1 個(gè)SNP。利用多因素方差分析模型分析GnRH基因SNP 多態(tài)性位點(diǎn)及其構(gòu)建的單倍型與性狀之間的關(guān)聯(lián)性，模型：Y=μ+Gi+eij,其中Y 為性狀觀測(cè)值，μ 是群體平均值，Gi為個(gè)體基因型，eij為隨機(jī)誤差。計(jì)算各個(gè)性狀對(duì)應(yīng)的基因型的最小二乘均數(shù)。顯著差異水平為P＜0.05，極顯著差異水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1GnRH基因SNP 多態(tài)性位點(diǎn)與體組成性狀的關(guān)聯(lián)分析 SNP 多態(tài)性位點(diǎn)與體組成性狀的相關(guān)分析結(jié)果（表1）表明，開產(chǎn)體重與g.1507C>T 和g.3099C>T 多態(tài)性位點(diǎn)顯著相關(guān)，體斜長(zhǎng)與g.408C>G、g.695T>C、g.1455A>G、g.1507C>T、g.1542A>G、g.1695A>G、g.1795C>T 位點(diǎn)顯著或極顯著相關(guān)；脛長(zhǎng)與g.356_352 del 5、g.742G>C、g.793G>A、g.1542A>G、g.2476T>C、g.2510T>C、g.2542T>C 和g.3113A>C 顯著或極顯著相關(guān)；龍骨長(zhǎng)與g.356_352 del 5、g.1307G>A、g.1311A>C、g.1695A>G 和g.1715C>A 顯著或極顯著相關(guān)；脛圍與g.687A>G、g.1307G>A、g.1311A>C 和g.1836T>C 位點(diǎn)顯著或極顯著相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）；GnRH基因SNP 位點(diǎn)與半潛水長(zhǎng)、骨盆寬和脛圍等性狀無(wú)顯著相關(guān)。

2.2GnRH基因SNP 多態(tài)性位點(diǎn)與鵝蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表2 可見，GnRH基因的9 個(gè)SNP 位點(diǎn)（g.218G>A、g.350G>A、g.490A>G、g.1366A>C、g.1832A>G、g.2085C>T、g.2908C>T、g.2961C>G 和g.3113A>C）與蛋殼強(qiáng)度顯著或極顯著相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）；g.695T>C、g.1143T>C 和g.1246T>C 位 點(diǎn) 與 蛋 殼 重顯著或極顯著相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）。GnRH基因SNP 位點(diǎn)與鵝蛋形指數(shù)、蛋比重、蛋黃顏色和蛋黃重等蛋品質(zhì)性狀無(wú)顯著相關(guān)。

2.3 單倍型與體組成性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表3 可知，window1、window4、window7、window10、window12、window19、window20、window23、window29、window32、window37、window38、window43 和window44，共14 個(gè)單倍型與初生重、體斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、龍骨長(zhǎng)和脛圍等性狀呈顯著或極顯著相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）。這些單倍型包括單位點(diǎn)顯著的21 個(gè)SNP 位點(diǎn)（表1），說(shuō)明這21 個(gè)SNP 可能是影響鵝的初生體重、體斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、龍骨長(zhǎng)和脛圍性狀的重要變異位點(diǎn)。

2.4 單倍型與蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表3 可知，window1、window6、window7、window9、window10、window12、window16、window43 和window44，共9個(gè)單倍型與蛋殼強(qiáng)度、蛋殼重和蛋殼厚度等性狀呈顯著或極顯著相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）。這些單倍型包括單位點(diǎn)顯著的19 個(gè)SNP 位點(diǎn)（表2），表明這19 個(gè)SNP 位點(diǎn)可能是影響鵝的蛋殼強(qiáng)度、蛋殼重和蛋殼厚度等性狀的重要變異位點(diǎn)。

3 討論

前期研究結(jié)果表明，GnRH基因在畜禽繁殖和體組成性狀等方面發(fā)揮重要功能[17,20-23]。因此本研究將GnRH基因的46 個(gè)SNP 位點(diǎn)與鵝的體組成和產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究該基因影響上述性狀的遺傳機(jī)理提供依據(jù)并提供相應(yīng)的潛在分子標(biāo)記。

人和哺乳動(dòng)物中研究表明，GnRH基因調(diào)控GnRH激素合成，影響與體組成相關(guān)的性腺分泌的激素，而且GnRH基因與青少年的體組成成分顯著相關(guān)[24]；哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)豬的體組成性狀和血液中的GnRH激素濃度與正常豬差異顯著[13]；與此類似，去勢(shì)羊血液體組成性狀和血液中的GnRH 激素濃度與正常組差異顯著[14]，推斷GnRH 激素濃度影響豬體組成性狀。綜上所述，本研究推測(cè)GnRH 的SNP 多態(tài)性位點(diǎn)，影響GnRH 分泌，直接或者間接影響鵝的體組成性狀，具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)，GnRH基因SNP 位點(diǎn)與四川白鵝蛋殼強(qiáng)度、蛋殼重和蛋殼厚度等指標(biāo)有顯著或極顯著的影響。值得注意的是，g.1366A＜C 突變位點(diǎn)造成谷氨酸到丙氨酸的突變，與蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度顯著相關(guān)，AA 基因型個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度均大于其他基因型個(gè)體。前期研究發(fā)現(xiàn)g.1366A＜C 突變位點(diǎn)與四川白鵝產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)，且AA 基因型個(gè)體產(chǎn)蛋數(shù)顯著低于CC 基因型個(gè)體[17]。研究發(fā)現(xiàn)褐殼純系蛋雞的蛋殼厚度與產(chǎn)蛋數(shù)負(fù)相關(guān)[25]，一定程度上解釋了g.1366A＜C 突變位點(diǎn)AA 基因型的蛋殼厚度高于其他基因型，而產(chǎn)蛋數(shù)顯著低于CC 基因型。研究表明鵝的GnRH基因SNP 位點(diǎn)與蛋重、產(chǎn)蛋數(shù)等顯著相關(guān)[17,21]，但對(duì)本研究中的4 個(gè)SNP 位點(diǎn)（g.1795C>T、g.1822A>G、g.2760T>C 和g.3348C>T）均未報(bào)道，可能是由于鵝品種、群體大小或者關(guān)聯(lián)分析的公式等不同造成結(jié)果差異。

表2 GnRH 不同基因型對(duì)鵝蛋品質(zhì)性狀的影響

蛋殼強(qiáng)度、蛋殼硬度和蛋殼重等指標(biāo)與鈣離子吸收相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，GnRH基因的21 個(gè)SNP 位點(diǎn)與蛋殼強(qiáng)度、蛋殼硬度和蛋殼重顯著或極顯著相關(guān)。GnRH的電生理特性及活性神經(jīng)元高度依賴于鈉、鉀、鈣和氯等離子通道活性及離子的濃度[26-27]。鉀、鈣、氯通道對(duì)靜息狀態(tài)的激活及GnRH 神經(jīng)元的激活，某些離子通道基因和特定離子的表達(dá)，離子狀態(tài)濃度狀態(tài)影響鵝蛋重量、蛋殼厚度[28]。推測(cè)GnRH與上述蛋品質(zhì)相關(guān)的SNP 位點(diǎn)的不同基因型的電生理特性不同，對(duì)應(yīng)的離子通道和離子濃度不同，因此蛋品質(zhì)在不同基因型也存在顯著差異，具體機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

表3 GnRH基因單倍型對(duì)鵝體組成和蛋品質(zhì)的影響（P值）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GnRH基因的多態(tài)性位點(diǎn)與鵝初生重、體斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、龍骨長(zhǎng)、脛圍、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼重和蛋殼厚度等性狀顯著或極顯著相關(guān)，是上述體組成和蛋品質(zhì)性狀的潛在分子標(biāo)記，有望應(yīng)用于鵝育種實(shí)踐并有助于上述性狀遺傳機(jī)理的研究。