樊慶燦

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000）

雞（gallus domesticus）是一種世界性的高質(zhì)量膳食蛋白來源，也是發(fā)育生物學(xué)和基因組學(xué)研究的重要模式生物，廣泛應(yīng)用在胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)功能、營養(yǎng)利用、激素敏感性和肥胖的基本機(jī)制研究中[1]。與哺乳動(dòng)物不同，雞天生血糖過高，這使它成為脂肪代謝相關(guān)研究的經(jīng)典模型動(dòng)物[2]。雞脂肪沉積相關(guān)基因的研究也篩選出一些潛在的關(guān)聯(lián)基因，如A-FAВP[3-4]、ACAA1[5]、RВ1[6]、ΙGFВF2[7]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析和表達(dá)譜分析成為篩選脂肪沉積相關(guān)基因的重要手段[2,8-11]，相關(guān)的數(shù)據(jù)庫建設(shè)也日趨完善。本研究利用GEO 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)（GSE3867），結(jié)合生物信息學(xué)和表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選雞肝臟中脂肪沉積相關(guān)基因，探討調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 表達(dá)譜數(shù)據(jù)獲取 本文所用RNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于美國國立生物技術(shù)信息中心基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO），數(shù)據(jù)編號(hào)為GSE3867。16 個(gè)樣本包括8 個(gè)低脂肪品系雞（≤1 %）的肝臟樣品（LF）和8 個(gè)高脂肪品系（≥3.2%）肝臟樣本（HF），屠宰周齡為8 周。LF 組編號(hào)分別為GSM88361、GSM8 8362、GSM88363、GSM88364、GSM88365、GSM883 66、GSM88367、GSM88368，HF 組編號(hào)分別為GSM8 8381、GSM88382、GSM88383、GSM88384、GSM883 85、GSM88386、GSM88387、GSM88388。雞基因組注釋文件來源于NCВΙ。韋恩圖部分?jǐn)?shù)據(jù)來源于NCВΙ生命科學(xué)期刊文獻(xiàn)數(shù)字化檔案庫。

1.2 生物信息學(xué)軟件 GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、箱線圖作圖和基因表達(dá)數(shù)據(jù)差異分析。使用STRΙNG（https：//stringdb.org/cgi/input.pl? sessionΙd=NPdugdyy2MoP&input_page_show_search=on）進(jìn)行顯著基因互作分析，Cytoscape 3.6.1 進(jìn)行基因和核心基因（hub gene）互作繪圖、GO 分析及作圖。DAVΙD（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）進(jìn)行KEGG 分析，使用Veen Diagram（http：// bioinformatics .psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制韋恩圖。

1.3 分析步驟 打開GEO 數(shù)據(jù)庫的在線軟件GEO2R，搜索編號(hào)GSE3867，定義LF 組和HF 組，選擇數(shù)據(jù)log 轉(zhuǎn)化，做箱線圖觀察所選樣本的表達(dá)值數(shù)據(jù)分布。選擇NCВΙ 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋。分析完成后，導(dǎo)出箱線圖和分析結(jié)果。

將P＜0.05 的基因?qū)隨tring 進(jìn)行基因互作分析，將最小綜合得分設(shè)為0.4，導(dǎo)出Network 數(shù)據(jù)。將Network 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoskype，進(jìn)行基因互作網(wǎng)絡(luò)作圖，cytoHubb 插件Degree 法進(jìn)行關(guān)鍵基因（hub gene）分析，使用ВΙNGO 插件進(jìn)行跨物種GO 分析并繪制層次網(wǎng)絡(luò)圖。將顯著基因?qū)隓AVΙD 進(jìn)行KEGG 分析。

將本研究得到的P＜0.05 的基因與在PMC 中查找最新的雞脂肪沉積相關(guān)的2 篇文獻(xiàn)[10-11]的顯著結(jié)果導(dǎo)入Veen Diagram 中，做韋恩圖并導(dǎo)出。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析 基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og 轉(zhuǎn)化后繪制箱線圖（圖1），16 個(gè)樣本上邊緣值和下邊緣值、上四分之一值和下四分之一值均有所差異，但中位數(shù)均位于0 附近，可以進(jìn)行表達(dá)譜數(shù)據(jù)的差異分析。

2.2 表達(dá)差異基因及互作分析 LF 組和HF 組基因肝臟表達(dá)差異顯著的基因及信息見表1，共篩選出26 個(gè)表達(dá)量差異顯著的基因，5 個(gè)基因達(dá)到極顯著水平，其中差異最顯著基因?yàn)镃YP2C45，其次為RPS4X、FASN、ΙNSR和SCD。26 個(gè)顯著基因的互作網(wǎng)絡(luò)見圖2。與LF 組相比，HF 組表達(dá)量下調(diào)的基因有8 個(gè)（白色），分別為CYP2C45、RPS4X、RPS25、ΙGFGP5、ACAT1、AGPAT4、PDPK1和PYGL；上調(diào)的基因有18 個(gè)（灰色），包括CYP2C45基因，該基因唯一的互作基因?yàn)橹舅岷铣擅富颍‵atty Acid Synthase，F(xiàn)ASN）。FASN的互作基因（圖3）中，CYP2C45、SCD和FASN為極顯著基因。采用Degree 法計(jì)算出4 個(gè)核心基因并繪制互作圖（圖4），重要性依次為FASN、PGK1、SREВF1、SCD，其 中FASN和SCD為差異極顯著基因。FASN與SCD、SREВF1、PGK1均有互作關(guān)系。

表1 HF 組和LF 組基因表達(dá)差異顯著的基因

2.3 GO 和KEGG 分析 對(duì)差異基因進(jìn)行生物過程的GO 分析并作層次圖（圖5），富集在新陳代謝過程的顯著基因最多，按照層次依次減少，最終富集在脂肪酸代謝、糖酵解和雙羧酸代謝過程。P值最小的為酒精代謝和小分子代謝。差異基因FASN、SCD、HMGCS1、PTEN和APOA1參與脂肪酸代謝過程，其中FSAN和SCD是差異極顯著基因。由顯著基因的KEGG 分析（圖6）可以看出，參與基因最多的通路為代謝調(diào)節(jié)通路（01100），CYP2C45參與了此通路。另外顯著基因參與了胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、丙酮酸代謝、碳代謝、脂肪酸代謝通路和過氧化物酶體增殖劑激活受體信號(hào)傳導(dǎo)通路。參與脂肪代謝調(diào)節(jié)（01212）的4 個(gè)基因（圖7）中，F(xiàn)ASN和SCD為表達(dá)差異極顯著基因。

2.4 共同基因分析 將本研究篩選的表達(dá)差異顯著基因與發(fā)表的脂肪組織差異表達(dá)基因[10-11]進(jìn)行韋恩圖解分析（圖8），發(fā)現(xiàn)FASN、SCD和FADS2基因?yàn)楣餐町惢颍渲蠪ASN和SCD為本研究篩選的差異極顯著基因。此外CYP2C45基因在本研究和Resnyk 等[10]的研究中均為表達(dá)差異基因。由圖9 可見，F(xiàn)ASN、SCD和FADS2基因之間均存在互作。

3 討論

本研究在HF 組和LF 組的雞肝臟中共篩選出26個(gè)表達(dá)差異顯著的基因，CYP2C45、FASN、SCD和FADS2是比較重要的關(guān)鍵基因。CYP2C45基因是差異表達(dá)最為顯著的基因，CYP2C45的互作基因?yàn)镕ASN，F(xiàn)ASN和SCD不僅是本研究篩選的表達(dá)差異極顯著基因，也是互作網(wǎng)絡(luò)計(jì)算出來的核心基因。GO 分析和KEGG 分析發(fā)現(xiàn)FASN和SCD參與了脂肪代謝調(diào)節(jié)。FADS2和FASN、SCD是與維恩圖解分析的相關(guān)基因，F(xiàn)ADS2還參與了脂肪代謝通路（01212）的調(diào)節(jié)。

CYP2C45是細(xì)胞色素P450（CYP450）家族的一員，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上混合功能氧化酶系統(tǒng)末端氧化酶，CYP酶在內(nèi)源性底物（如甾體激素、前列腺素和膽汁酸）的生物合成中起著關(guān)鍵作用，CYP2C在不飽和脂肪酸的調(diào)節(jié)中具有重要作用[12]。而CYP2C45是CYP2C家族成員之一，主要在動(dòng)物肝臟和小腸中表達(dá)，是雞的肝臟中表達(dá)最豐富的亞型，研究發(fā)現(xiàn)中填飼組鵝CYP2C45表達(dá)量與對(duì)照組差異顯著，且CYP2C45參與調(diào)節(jié)丙酮酸激酶和花生四烯酸脂肪氧化酶的表達(dá)[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)CYP2C45在低脂組雞中表達(dá)量較高，說明該基因的表達(dá)可能與脂肪的降解有關(guān)。FASN為脂肪酸合成酶的多酶復(fù)合體，它能夠識(shí)別底物并最終合成16 個(gè)碳原子的飽和脂肪酸鏈，并在此基礎(chǔ)上合成其他脂肪酸[14]。該基因廣泛存在于動(dòng)物的各個(gè)組織中，但在雞的肝臟組織中表達(dá)量最豐富。研究發(fā)現(xiàn)脂肪沉積較少的品種中，肝臟組織中FASN的表達(dá)量較少[15]。SCD是硬脂酰輔酶 A 去飽和酶，為脂肪代謝過程中的Δ9 去飽和酶，能夠影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性[16]，參與雞肝臟對(duì)脂肪代謝的調(diào)節(jié)[17]，維持血脂濃度平衡[9]。FADS2是脂肪代謝過程中Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，該基因在不飽和脂肪酸的合成中具有關(guān)鍵的作用[18]，研究發(fā)現(xiàn)該基因能顯著影響雞的肌肉脂肪含量[19]。

在本研究篩選出的關(guān)鍵基因中，F(xiàn)ASN是脂肪酸合成酶基因，SCD和FADS2為脂肪酸去飽和酶基因，CYP2C45基因參與去飽和酶的表達(dá)的調(diào)節(jié)[13]。不飽和脂肪酸是脂肪酸合成后在不同的去飽和酶作用下生成的。4 個(gè)關(guān)鍵基因均與不飽和脂肪酸合成有關(guān)。不飽和脂肪酸能提高脂蛋白脂酶、LDL 受體的活性等，可以加速脂肪代謝和抑制脂肪合成[20]。

差異基因的GO 分析發(fā)現(xiàn)顯著基因參與了糖酵解和雙羧酸代謝等過程，KEGG 分析發(fā)現(xiàn)差異基因參與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、丙酮酸代謝等途徑，這些均屬于糖代謝的一部分。糖代謝途徑是脂肪酸合成所需要的炭骨架來源，為脂肪的合成提供了甘油骨架、乙酰輔酶A、還原氫以及能量，脂代謝和糖代謝是密不可分的。

4 結(jié)論

本研究共篩選出肝臟中26 個(gè)表達(dá)差異基因與雞的脂肪沉積有關(guān)，關(guān)鍵基因CYP2C45、FASN、SCD、FADS2均與不飽和脂肪酸的合成有關(guān)。此外，糖代謝可能參與脂肪代謝的調(diào)節(jié)。