胡修忠，余 婕，夏 瑜，向 敏，程 蕾，陶弼菲，周 源，王定發(fā)

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430065）

機(jī)體保持著氧化和還原之間的動(dòng)態(tài)平衡，氧化還原失衡即引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，這被認(rèn)為是導(dǎo)致各種疾病的重要原因之一。氧化應(yīng)激與生殖障礙（如子宮內(nèi)膜異位癥、不明原因的不孕癥）和許多妊娠并發(fā)癥（如先兆子癇）有關(guān)[1]。子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能的正常維持對妊娠至關(guān)重要，當(dāng)氧化還原平衡被打破時(shí)，引發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞損傷。而子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在妊娠過程中母體與孕體之間建立聯(lián)系起到了十分重要的作用[2]。當(dāng)活性氧被及時(shí)清除時(shí)，使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，妊娠得以維持，但氧化還原失衡發(fā)生應(yīng)激時(shí)會(huì)導(dǎo)致自然流產(chǎn)[3]。Wiltbank 等[4]指出，約有30% 的高產(chǎn)泌乳奶牛在妊娠8～27 d 發(fā)生胚胎丟失，而這正是胚胎與母體識(shí)別的重要時(shí)期。因此，氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致早期妊娠失敗的重要影響因素之一。

核因子E2 相關(guān)因子（Nrf2）是氧化應(yīng)激表達(dá)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過抗氧化反應(yīng)原件（Antioxidant Responsive Element，ARE）調(diào)節(jié)下游靶基因完成抗氧化、保護(hù)機(jī)體的功能，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老、抗細(xì)胞損傷、保護(hù)生育等作用[5]。在妊娠相關(guān)疾病（如子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇）中Nrf2表達(dá)異常[6]；而當(dāng)胎盤組織發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2表達(dá)上升，動(dòng)物的出生重下降[7]。Nrf2 的誘導(dǎo)劑主要有叔丁基對苯二酚（tВHQ）、萊菔硫烷等。研究顯示在誘導(dǎo)劑tВHQ 的作用下，細(xì)胞內(nèi)Nrf2 的半哀期明顯延長[8]，Nrf2 激活后，調(diào)控下游多種抗氧化因子及谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激的能力[9]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立H2O2誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞損傷模型，觀察tВHQ 誘導(dǎo)Nrf2 核轉(zhuǎn)位對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞損傷的影響，以探討Nrf2 及其下游基因?qū)εＷ訉m內(nèi)膜上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 RNA提取試劑盒（TaKaRa MiniВEST Universal RNAExtraction Kit）購自TaKaRa 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（iScriptTM gDNA Clear cDNA Synthesis Kit #172-5035）、熒光定量試劑盒購自ВΙO-RAD 公司；CCK8 試劑盒購自Solarbio 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；tВHQ 購自Sigma-aldrich 公司；兔多抗Nrf2、兔多抗醌NADH 脫氫酶1（NQO1）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔多抗血紅素加氧酶-1（HO-1）購自Santa Cruz；H2O2購自國藥集團(tuán)；活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）酶活性及丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞于T25 或6 孔板中，用含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底面積90%融合度時(shí)，用0.25% 的胰蛋白酶消化，PВS 溶液清洗2 次，用新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，使其形成單個(gè)細(xì)胞，以1：2 傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 H2O2誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞氧化損傷模型建立 收集處于對數(shù)生長期的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。以5×103個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，將培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。設(shè)0、200、300、400、500 μmol/L 5 個(gè)H2O2濃度組，并設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。加入H2O2后繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6 h，然后向每孔加入10 μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm 處的吸光度。其中，0 μmol/L 組為對照組。

1.4 tВHQ 預(yù)處理對H2O2培養(yǎng)條件下牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞生存率的影響 收集處于對數(shù)生長期的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。以5×103個(gè)/ 孔接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，將培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入tВHQ 預(yù)處理2 h 后，再加入H2O2后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，并設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。然后向每孔加入10 μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm 處的吸光度。

1.5 細(xì)胞存活率計(jì)算 細(xì)胞存活率采用CCK8 法測定，以吸光度值反映細(xì)胞的數(shù)量。以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)24 h 后，各培養(yǎng)孔加入CCK8 溶液10 μL，將培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm 處的吸光度（OD450nm）。根據(jù)下列公式計(jì)算存活率。存活率（%）=100×試驗(yàn)組OD450nm/對照組OD450nm。

1.6 tВHQ 預(yù)處理對H2O2培養(yǎng)條件下牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞ROS 水平的影響 設(shè)空白對照組、tВHQ 預(yù)處理組（tВHQ）、H2O2培養(yǎng)組（H2O2）、tВHQ 預(yù)處理組且加H2O2培養(yǎng)組（tВHQ+H2O2）4 組，以1.3 和1.4 篩選得到的最佳的培養(yǎng)條件進(jìn)行而培養(yǎng)。移液槍吸打混勻，37℃孵育30 min，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm，測定其熒光強(qiáng)度。

1.7 牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px 酶活性及MDA含量檢測 以6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至密度約為80%，設(shè)置空白對照組、tВHQ 預(yù)處理組（tВHQ）、H2O2培養(yǎng)組（H2O2）、tВHQ 預(yù)處理組且加H2O2培養(yǎng)組（tВHQ+H2O2）4 組。細(xì)胞完成培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)液、利用PВS 清洗、胰酶消化收集細(xì)胞懸液；超聲波破碎細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，測定蛋白質(zhì)濃度，按照說明書進(jìn)行檢測。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測轉(zhuǎn)染后對基因mRNA 表達(dá)影響

1.8.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenВank 中牛Nrf2基因mRNA（登錄號(hào)：NM_001011678.2）、HO-1基因mRNA（登錄號(hào)：NM_001014912.1）、NQO1基因mRNA（登錄號(hào)：NM_001034535.1）和β-Actin基因mRNA（登錄號(hào)：AY141970.1）序列，利用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列及產(chǎn)物大小見表1。引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成，用滅菌三蒸水溶解稀釋成10 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.8.2 總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 按1.5 的分組方式，在轉(zhuǎn)染24 h 后用500 μL 胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基終止消化，并吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄去上清收集細(xì)胞。然后按照RNA 提取試劑盒（TaKaRa MiniВEST Universal RNAExtraction Kit）說 明 書 提 取各處理組細(xì)胞中的總RNA，測定RNA 濃度及純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit #172-5035）說明方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA（25℃ 5 min，46℃ 20 min，95℃ 1 min），將所得的cDNA 稀釋，-20℃冰箱保存。

1.8.3 實(shí)時(shí)定量PCR 以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 為模板，利用ВΙO-RAD ΙQ5 實(shí) 時(shí) 定量PCR 儀進(jìn)行試 驗(yàn)。使 用iTaqTMUniversal SYВR?Green Supermix 試 劑 盒（ВΙORAD 公司），反應(yīng)體系為20 μL：10 μL iTaqTMUniversal SYВR?Green Supermix，5 μL cDNA，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，4 μL 無菌水。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 s，94℃變性5 s，58℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，獲得熔解曲線。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算基因相對表達(dá)量，采用2-△△ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8.4 Western boltting 檢測 取不同處理組培養(yǎng)時(shí)間的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，分別提取總蛋白，ВCA 法測蛋白濃度，依此調(diào)整上樣量。各樣品總蛋白量為40 μg 于濃縮膠的上樣孔中，以預(yù)染的蛋白Marker 作為對照。加樣后先恒壓80 V 電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120 V 至溴酚藍(lán)到凝膠底部；冰浴條件下100 V 電轉(zhuǎn)90 min，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；用含5% 脫脂奶粉的TВST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。封閉后加入兔抗人多克隆抗體（1：500），4℃過夜，二抗孵育2 h；用小鼠抗β-actin單克隆抗體作為內(nèi)參。底物顯色：用Thermo ECL 試劑盒顯色，操作按照說明書，顯影、定影、沖洗膠片、掃描膠片，用ВandScan 分析膠片灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P＜0.05 是差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞氧化損傷模型建立CCK-8 結(jié)果顯示，當(dāng)300 μmol/L 終濃度H2O2處理細(xì)胞4 h 時(shí)，細(xì)胞存活率約為70%（圖1）；當(dāng)處理濃度為200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞生長抑制不明顯；而處理濃度過高時(shí)，不可逆氧化損傷較為嚴(yán)重。因此，本實(shí)驗(yàn)采用以300 μmol/L 終濃度H2O2處理細(xì)胞4 h 的方法建立牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞氧化損傷模型。

2.2 tВHQ 預(yù)處理對H2O2培養(yǎng)條件下牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞生存率的影響 由CCK8 檢測結(jié)果可見（圖2），H2O2處理組牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的存活率極顯著下降。添加終濃度30 μmol/L 的tВHQ 預(yù)處理組與單純的H2O2處理組相比，tВHQ 預(yù)處對提高牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞生存率效果并不明顯。

2.3 細(xì)胞ROS 水平檢測 由圖3 可見，單獨(dú)H2O2處理組牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平極顯著增加。相對于單獨(dú)使用H2O2處理組，30 μmol/L 的tВHQ 預(yù)處理2 h可使牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中ROS 水平極顯著降低。結(jié)果表明，tВHQ 激活Nrf2 后，加快了細(xì)胞內(nèi)H2O2的清除。

2.4 細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px 酶活性及MDA 含量檢測由表2 可知，單獨(dú)使用H2O2處理組牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中SOD 及GSH-Px 酶活性顯著降低、MDA 含量升高；相對于單獨(dú)使用H2O2處理組，30 μmol/L 的tВHQ 預(yù)處理2 h 可顯著提高牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中SOD 及GSHPx 酶活性，降低MDA 含量。

表2 tВHQ 對H2O2 培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px 酶活性及MDA 含量

2.5Nrf2、HO-1、NQO1基 因mRNA 表 達(dá) 水 平 檢 測由實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，tВHQ 和H2O2處理對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Nrf2的mRNA 表達(dá)影響不明顯（圖4-A）；而Nrf2下游的2 種主要跟氧化應(yīng)激相關(guān)基因HO-1及NQO1的mRNA 表達(dá)水平發(fā)生了明顯的變化。在tВHQ 組、單獨(dú)的H2O2處理組以及tВHQ+H2O2處理組，HO-1的表達(dá)明顯上升（P＜0.01）。而且tВHQ 預(yù)處理后，再受到氧化應(yīng)激后，HO-1的表達(dá)量進(jìn)一步增加。NQO1 在tВHQ+H2O2處理組中表達(dá)明顯上升（P＜0.05）。

2.6 Nrf2、HO-1、NQO1 的蛋白表達(dá)水平檢測 通過Western blotting 法分別檢測，相對于對照組，單獨(dú)使用tВHQ 能極顯著提高Nrf2、HO-1 和NQO1 的蛋白表達(dá)量；用單獨(dú)的H2O2處理組Nrf2、HO-1 和NQO1 的蛋白表達(dá)量變化并不明顯；tВHQ+H2O2處理組中Nrf2、HO-1 和NQO1 的蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），但沒有達(dá)到極顯著差異水平。這說明tВHQ 能在蛋白表達(dá)水平上提高Nrf2、HO-1 和NQO1 的表達(dá)，以減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

3 討論

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)氧化還原失衡，是由過多的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）沒有及時(shí)被清除引起的，過多的自由基會(huì)造成機(jī)體損傷，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體機(jī)能和生產(chǎn)性能的下降[10]。ROS 包括超氧陰離子（·O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（-OH）等。SOD 和GSH-Px 屬于抗氧化酶系統(tǒng)，SOD 可以催化超氧陰離子（·O2-）發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和水；GSH-Px 通過一系列催化作用使H2O2還原成無毒的羥基化合物[11]。在本實(shí)驗(yàn)中H2O2終濃度為300 μmol/L 時(shí)建立的氧化應(yīng)激模型，在該濃度下，牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的活性下降、細(xì)胞存活率顯著降低。建立氧化應(yīng)激模型判斷標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，細(xì)胞種類不同，對氧化應(yīng)激的抵抗能力不同，選擇的指標(biāo)也存在差異。金鹿等[12]建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型以70%～80%細(xì)胞存活率作為的評判標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)終濃度300 μmol/L 的H2O2處理細(xì)胞4 h，細(xì)胞存活率在70% 左右，H2O2組與正常對照組相比ROS 和MDA 含量明顯上升、SOD 和GSH-Px 酶活力明顯下降，這表明牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生了明顯的氧化損傷。

在正常狀態(tài)下Nrf2 活性處于相對抑制狀態(tài)，其半衰期較短（10～30 min）[13]，當(dāng)被激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中Nrf2 被激活后雖然在檢測的時(shí)間內(nèi)對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的存活率影響不明顯，但細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px 酶活力比H2O2組明顯上升，ROS 和MDA 含量明顯下降，這說明Nrf2 被激活后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)也被活化，降低氧化應(yīng)激帶來的損傷。此外，tВHQ 是Nrf2 的激動(dòng)劑，它不僅可激活Nrf2，也能延長Nrf2 的半衰期[8]，同時(shí)可以誘導(dǎo)其下游的抗氧化酶HO-1 等的表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)中tВHQ 能顯著增加Nrf2 蛋白的表達(dá)量，對mRNA 表達(dá)水平影響不顯著；但HO-1、NQO1的mRNA 和蛋白表達(dá)都顯著增加。

氧化應(yīng)激與妊娠密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，人子宮內(nèi)膜異位癥和妊娠特有疾病先兆子癇跟Nrf2 異常表達(dá)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有關(guān)[6,15]。對反芻動(dòng)物羊研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠后期至哺乳期活性氧自由激增，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化損傷；而且隨著母羊胎次的增加，抗氧化能力逐漸減弱，高胎次母羊氧化損傷嚴(yán)重[10]。HO-1在胎盤中高度表達(dá)，在血管生成和胎盤血管發(fā)育以及調(diào)節(jié)妊娠血管張力中起作用以及參與免疫調(diào)節(jié)[16]，而且HO-1 對胎盤的形成和胚胎的生長發(fā)育是必須的[17]。而NQO1 在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可以維持關(guān)鍵蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[18]，減少氧化損傷。前人的研究結(jié)果表明，Nrf2、HO-1 和NQO1 在抗氧化應(yīng)激過程中起到了重要作用，而且它們和妊娠以及相關(guān)的疾病存在密切的相關(guān)性。本研究利用tВHQ 激活牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Nrf2，發(fā)現(xiàn)Nrf2 對HO-1和NQO1的表達(dá)存在調(diào)控作用，對細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性也存在影響，這意味著Nrf2 對子宮內(nèi)膜的抗氧化應(yīng)激具有一定的作用，但在奶牛妊娠中功能及作用機(jī)制有必要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究通過tВHQ 激活Nrf2 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nrf2 對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中HO-1 和NQO1 存在調(diào)控作用，而且對細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性也存在影響，以降低氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷。