楊 洋，陳浩林*，徐 敏，倪 鍇

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025）

ADΙPOQ 又稱脂聯(lián)素或脂肪連接蛋白（Adiponetin），是一種具有生物活性的脂肪因子，由脂肪組織分泌[1]。ADΙPOQ基因最初在人類染色體上被發(fā)現(xiàn)，對生理功能的調(diào)控主要是通過與ADΙPOQ受體結(jié)合，然后對AMP激酶與PPAR 配體的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而調(diào)控脂肪氧化和細(xì)胞糖類的攝取[2]。ADΙPOQ基因主要與胰島素耐受性調(diào)節(jié)、Ⅱ類糖尿病以及機(jī)體肥胖等多種生理疾病相關(guān)[3]，隨著對該基因的深入研究，發(fā)現(xiàn)ADΙPOQ基因在脂質(zhì)代謝的調(diào)控中也具有重要作用，已有研究發(fā)現(xiàn)ADΙPOQ基因在脂質(zhì)代謝上的調(diào)控作用主要是通過促進(jìn)脂肪酸氧化和抑制脂質(zhì)合成達(dá)到降脂的作用[4]。迄今為止，對于ADΙPOQ基因在調(diào)控動物脂質(zhì)代謝上的研究主要集中在人類和嚙齒動物上[5]，在畜禽上的研究相對較少。在豬上的研究發(fā)現(xiàn)，ADΙPOQ基因的組織特異性表達(dá)與脂肪沉積有關(guān)[6]；在肉牛育肥前期，ADΙPOQ基因表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，育肥后期則與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)[7]。以上研究表明ADΙPOQ基因在脂肪合成代謝中起到重要作用，且可能是影響肌內(nèi)脂肪的重要候選基因。目前關(guān)于ADΙPOQ基因在貴州黑山羊上的研究尚沒有報道，因此本實驗通過對ADΙPOQ基因在黑山羊不同組織變動分析及脂肪組織的時序表達(dá)研究，探討ADΙPOQ基因?qū)谏窖蛉赓|(zhì)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 采集12 月齡貴州黑山羊心、肝、脾、肺、腎、胃、背最長肌和脂肪組織以及1 月齡、3 月齡、6 月齡、9 月齡和12 月齡5 個不同時間段的黑山羊脂肪組織。

1.1.2 主要試劑 熒光定量試劑盒，購自上海索萊寶生物科技有限公司；TRΙzol 試劑、無水乙醇、氯仿、異丙醇、75%酒精，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 微量紫外分光光度計、實時熒光定量PCR 儀，均購自Thermo Scientific；超凈工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCВΙ 上山羊ADΙPOQ基因的mRNA 序列（登錄號：NM_001287573.1），使用Primer5.0 軟件設(shè)計ADΙPOQ基因的上下游熒光引物，將設(shè)計的引物序列交由賽默飛世爾科技（中國）有限公司進(jìn)行合成，GAPDH基因作為熒光定量的內(nèi)參基因，設(shè)計合成序列及內(nèi)參基因序列信息見表1。

表1 引物信息

1.2.2 組織RNA 的提取 將采集的各組織樣品用TRΙzol 法進(jìn)行組織RNA 提取，并將提取的RNA 通過紫外分光光度計檢測其純度和濃度，各組織樣品RNA OD 值在1.8～2.0。

1.2.3 cDNA 的合成 將提取的組織RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)總體系20 μL：RNA 模板1 μL、Primer Mix 1 μL、dNTP Mix 2 μL、5×RT Вuffer 4 μL、Ribo Lock RNase Ιnhibitor1 μL、Revert Aid M-Mu LV RT 1 μL、ddH2O 10 μL。反應(yīng)條件為65℃5 min，42℃ 60 min，25℃ 5 min，70℃終止反應(yīng) 5 min。

1.2.4 組織熒光定量PCR 將逆轉(zhuǎn)錄得到的黑山羊各組織和不同階段脂肪組織cDNA 經(jīng)熒光定量PCR 檢測ADΙPOQ基因的表達(dá)，熒光定量PCR 反應(yīng)體系為25 μL：各組織cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，熒 光 染 料12.5 μL，無酶水9.5 μL。熒光 定量反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性3.5 min；95℃變性 10 s，58.5℃退火30 s，40 個循環(huán)；每個組織樣采用3 個重復(fù)組。

1.2.5 統(tǒng)計分析 將熒光定量反應(yīng)得到的數(shù)據(jù)經(jīng)2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析處理后，再使用SPSS19.0 對分析得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.01 代表差異極顯著，P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑山羊不同組織ADΙPOQ基因表達(dá)分析 設(shè)計引物經(jīng)測序比對，結(jié)果與設(shè)計合成序列一致，且經(jīng)熒光定量PCR 反應(yīng)，ADΙPOQ基因與內(nèi)參GAPDH基因的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)“S”型，且拐點清晰，熔解曲線均只有一個峰，說明熒光引物特異性較好（圖1、圖2）。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，ADΙPOQ基因在黑山羊檢測的各組織中均有表達(dá)，說明表達(dá)具有廣譜性；ADΙPOQ表達(dá)量從高到低依次為脂肪、背最長肌、脾、肺、肝、胃、心、腎；脂肪組織中表達(dá)量極顯著高于其他組織；背最長肌與脾中的表達(dá)量均極顯著高于肺、肝、胃、心等組織中的表達(dá)，在背最長肌和脾中的表達(dá)量無顯著差異。ADΙPOQ在肺和肝中的表達(dá)量極顯著高于胃、心和腎中的表達(dá)量，在肺與肝中的表達(dá)量無顯著性差異。ADΙPOQ在胃和心中的表達(dá)量極顯著高于腎的表達(dá)量，在胃和心中的表達(dá)量無顯著性差異（圖3）。

2.2ADΙPOQ基因在脂肪組織中的時序表達(dá)分析 由圖4可見，ADΙPOQ基因整體的表達(dá)趨勢先升高再降低，其中在6 月齡黑山羊脂肪組織中表達(dá)量最高，在12 月齡表達(dá)量最少，在6 月齡與3 月齡的表達(dá)量極顯著高于1 月齡、9 月齡和12 月齡，而在6 月齡與3 月齡之間表達(dá)量無顯著差異，在1 月齡的表達(dá)量極顯著高于9 月齡和12 月齡，在9 月齡和12 月齡之間的表達(dá)量無顯著差異。

3 討論

ADΙPOQ 主要是由脂肪組織分泌，而前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的過程中有很多調(diào)控因子起到調(diào)控的作用[8]，ADΙPOQ基因參與血脂血糖代謝、炎癥等病理生理過程。張輝[9]等研究結(jié)果表明，ADΙPOQ基因在牛的脂肪代謝過程中起到重要作用。叢立新[10]等研究表明，ADΙPOQ基因的特異表達(dá)與其背膘厚度具有一定的相關(guān)性。Wang[11]等研究結(jié)果顯示，ADΙPOQ基因在豬的脂肪細(xì)胞中表達(dá)豐富，同時有研究發(fā)現(xiàn)該基因在雞和鴨的脂肪組織中的表達(dá)量均最高[12-13]，本實驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，說明ADΙPOQ基因的表達(dá)在不同物種脂肪組織中均起到重要作用。李雪梅[14]等研究了ADΙPOQ基因在藏山羊不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果顯示ADΙPOQ基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，在肌肉組織和胃中表達(dá)量較低，而在其他各組織中未檢測到表達(dá)。而本研究中，ADΙPOQ基因在黑山羊脂肪組織中表達(dá)量最高，在胃中表達(dá)量較低，但在其他組織中均檢測到了ADΙPOQ基因的表達(dá)，且在背最長肌中的表達(dá)量較高，由此可說明在不同品種山羊的組織中，ADΙPOQ基因的表達(dá)有一定差異性。通過在荷斯坦新生犢牛前體脂肪細(xì)胞體外單層貼壁培養(yǎng)中的研究發(fā)現(xiàn)，ADΙPOQ基因在前體脂肪細(xì)胞不同的培養(yǎng)時期均有表達(dá)，而且ADΙPOQ基因的表達(dá)水平隨著脂肪細(xì)胞分化的成熟逐漸增高，到培養(yǎng)的12 d 表達(dá)最高[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)，隨著黑山羊年齡的逐漸增長，ADΙPOQ基因的表達(dá)量先增加再減少，在6 月齡的表達(dá)量達(dá)到最高，這可能與6 月齡時黑山羊肌內(nèi)脂肪含量較高有關(guān)。同時在延邊黃牛脂肪組織的研究結(jié)果顯示，ADΙPOQ基因的表達(dá)與肌肉內(nèi)脂肪的含量呈正相關(guān)關(guān)系[16]。由此可以說明ADΙPOQ基因的表達(dá)在脂肪細(xì)胞的分化過程中和脂質(zhì)的集聚過程中可能起到一定的促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本實驗通過對黑山羊不同組織中ADΙPOQ基因表達(dá)的分析和不同時期脂肪組織中的表達(dá)規(guī)律研究表明，ADΙPOQ基因在12 月齡黑山羊不同組織中均有表達(dá)，且在脂肪組織中表達(dá)量最高；ADΙPOQ基因在1 月齡到12 月齡黑山羊脂肪組織中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增加隨后減少的趨勢，且在6 月齡表達(dá)量最高，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究ADΙPOQ基因?qū)χ敬x的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。