周博 田茂生 馬晨 任曉朦 朱傳福

血小板主要用于止血和預防出血，但由于血小板表面存在復雜的抗原系統(tǒng)，多次輸注血小板的患者會引起同種免疫反應，進而造成血小板輸注無效（platelet transfusion refractory，PTR）。引起血小板同種免疫的抗原主要包括HLA-I類抗原和HPA。且血小板表面的HLA抗原主要為 HLA-A，B 抗原，而無 HLA-Ⅱ類抗原[1]。實踐證明，為PTR患者輸注HLA和HPA配型相合的血小板可以顯著提高血小板輸注效果。為此，我們采用PCR-SBT和PCR-SSP技術(shù)對淄博地區(qū)單采血小板捐獻者HLA-A，B 和HPA1-17系統(tǒng)等位基因進行檢測分析，探知其分布特點，以期建立起已知基因型血小板捐獻者資料庫，為臨床PTR患者搜尋HLA/HPA基因匹配的血小板，并為進一步擴充山東省級區(qū)域的血小板捐獻者庫提供資料，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 研究對象 本研究隨機選擇在本站登記、戶籍為淄博地區(qū)漢族單采血小板獻血者200名，其中男性178名，女性22名，年齡18～45 歲，采集靜脈血5 mL，采用EDTA抗凝，放置–40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 儀器與試劑

2.1 試劑：HLA基因分型：HLAssureTM SE SBT HLA-A/B Typing Kit（中國臺灣TBG TexasBiogen Inc. LotMA16081G2）；HPA基因分型：HPAtypeTM Platelet SSP Typing Kit（中國臺灣TBG TexasBiogen Inc. LotM316101）; 天根血液基因組DNA提取試劑盒（批號：P4701）。所有試劑均在有效期內(nèi)。

2.2 儀器：EZBead System 32 核酸提取儀，PE 9700擴增儀，eppendorf 5810R離心機，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)，ABI 3730XL測序儀。所有設備運行正常，均符合使用要求。

3 操作方法

3.1 DNA制備：使用DNA提取試劑盒，嚴格按說明書進行操作，進行全血基因組 DNA 提取， DNA濃度（30～50）ng /μL，純度A260/280=1.7～2.0。

3.2 HLA-A，B基因分型：采用PCR-SBT方法對HLA-A、B位點進行基因分型，結(jié)果由Accutype（Version: 1.5.673 5.332 29）軟件判讀，確定HLA中低分辨分型結(jié)果。

3.3 HPA1-17基因分型：采用PCR-SSP法嚴格按說明書進行操作，PCR產(chǎn)物分析采用TBE 緩沖液制備的2.5% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，150 V電泳15 min后，在全自動凝膠成像儀上拍照記錄結(jié)果，對照反應格局圖，判斷 HPA1-17基因型。

4 統(tǒng)計學分析 HLA和HPA基因頻率采用直接計數(shù)法計算，并用χ2檢驗進行HPA分布的 Hardy-Weinberg平衡驗證；比較淄博地區(qū)和其它群體中基因分布的差異采用χ2檢驗， HPA對偶抗原不配合概率（mismatch possibility, MMP）=2ab（1-ab），a、b為對偶抗原等位基因頻率[2]。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 淄博地區(qū)血小板捐獻者 HLA-A、HLA-B 位點基因頻率 共檢出HLA-A，B位點等位基因44個，其中HLA-A 位點低分辨等位基因15個，基因頻率較高的是A*02 、A*24、 A*11、A*30、A*33（表1）;HLA-B位點低分辨等位基因29個，基因頻率居前五位的是B*13、B*15、B*40、B*44、B*51（表2）。

表1 淄博地區(qū)血小板捐獻者 HLA-A位點低分辨等位基因頻率

2 淄博地區(qū)血小板捐獻者HLA-A，B部分高頻等位基因與中國其他地區(qū)和民族的比較，見表3。

3 淄博地區(qū)血小板捐獻者HPA1-17基因型和基因頻率分布 HPA1-17中，HPA4a、7a-14a、16a、17a呈單特異性，未檢測出相應的對偶基因抗原 HPA-b;在 HPA1-17 中，雜合度最高的是 HPA15，基因型HPA15a /15a、HPA15a /15b、HPA15b/15b 的頻率分別是 0.275 0、0.530 0、0.195 0; 基因型 HPA3a/3a、HPA3a /3b、HPA3b/3b的頻率分別是 0.345 0、0.500 0、0.155 0（表4）。

4 淄博地區(qū)血小板捐獻者HPA基因頻率與不同國家和地區(qū)的比較 ，見表5。

討 論

血小板輸注無效（PTR）在臨床上相當棘手，困擾著臨床醫(yī)生和病患。HLA抗體是導致PTR最常見的免疫因素，占所有免疫因素的80%和所有病因的11.7%[10]。淄博地區(qū)血小板捐獻者HLA-A，B 中基因頻率較高的有A*02、A*24、 A*11、A*30、A*33和B*13、B*15、B*40、B*44、B*51，與同屬于山東地區(qū)的尹作梅等[3]報道的基因頻率相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；淄博地區(qū)血小板捐獻者HLA-A位點基因頻率較高的前五位與中國其他地區(qū)和民族的比較后發(fā)現(xiàn)，A*02、A*24、A*33的基因頻率差異不具統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；A*11、A*30與廣東[4]相比，A*30與北方漢族[5]、寧夏回族[6]、中國滿族[7]相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。HLA-B位點部分高頻等位基因與中國其他地區(qū)和民族比較后可以看出，B*15、B*40、B*51的基因頻率差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B*13與寧夏回族[6]、B*44與廣東[4]相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此可見，淄博地區(qū)血小板捐獻者HLA基因分布具有區(qū)域性特點，說明建立區(qū)域性已知HLA基因型血小板捐獻者資料庫具有重要意義。HPA即血小板特異性抗原，由于不同人群、種族和地區(qū)間的各個抗原的頻率有可能不同，導致血小板免疫抗體產(chǎn)生的特點有差異，引發(fā)的血小板免疫性疾病的機會也有差異[11]。淄博地區(qū)血小板捐獻者 HPA1-17中，雜合度最高的是HPA15，基因型HPA15a /15a、HPA15a /15b、HPA15b/15b 頻率分別是 0.275 0、0.530 0、0.195 0。淄博地區(qū)的HPA-1-17系統(tǒng)基因分布頻率與馮云飛等[8]報道差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HPA-2與HPA-15系統(tǒng)和上海漢族[9]、中國臺灣[8]相比較，HPA-5與重慶漢族[9]相比差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；淄博漢族與英國人[8]（白種人）及美國黑人[8]的遺傳背景明顯不同。因此淄博漢族人群與此二群體的基因分布在多個HPA系統(tǒng)差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。通過對HPA不配合率的計算發(fā)現(xiàn)，淄博地區(qū)血小板捐獻者中HPA不配合率較高的為HPA3、HPA15，分別為0.365 8、0.373 4。本研究對淄博地區(qū)血小板捐獻者HLA-A、B和HPA1-17基因多態(tài)性進行檢測，分析探知了淄博地區(qū)血小板捐獻者 HLA-A，B和HPA1-17的分布特點，初步建立了血小板捐獻者HLA和HPA已知基因型資料庫，可以為產(chǎn)生HLA、HPA抗體的患者選擇HLA、HPA匹配的血小板輸注，以提高血小板輸注的安全性和有效性。目前，省內(nèi)多家市級中心血站已初步建立起各自的區(qū)域性血小板供者庫，鑒于山東人群遺傳背景相近，有效整合現(xiàn)有各個地市血小板供者資源，建設一個省級區(qū)域性血小板資料庫更具有實際意義，本研究必會成為正在完善中的山東省區(qū)域性血小板捐獻者資料庫的有益補充。

表2 淄博地區(qū)血小板捐獻者 HLA-B位點低分辨等位基因頻率

表3 淄博地區(qū)血小板捐獻者HLA-A，B部分高頻等位基因與中國其他地區(qū)和民族的比較

表4 淄博地區(qū)血小板捐獻者HPA基因型和基因頻率分布

表5 淄博地區(qū)血小板捐獻者HPA基因頻率與不同國家和地區(qū)的比較

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突