孟幼青，汪恩國，余繼華，鐘列權(quán)，李艷敏，殷琛

(1.浙江省植保檢疫與農(nóng)藥管理總站，浙江 杭州 310020； 2.臨海市農(nóng)技推廣中心，浙江 臨海 317000；3.臺(tái)州市黃巖區(qū)植物檢疫站，浙江 黃巖 318000； 4.臺(tái)州市植物保護(hù)檢疫站，浙江 椒江 318000)

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)作為一種寄生于柑橘韌皮部篩管細(xì)胞的革蘭氏陰性細(xì)菌，可干擾線粒體和葉綠體正常功能，致樹冠梢葉失綠黃化、果實(shí)著色異常和組織器官營養(yǎng)輸送受阻，最終導(dǎo)致柑橘全株枯死[1]。浙江是我國柑橘重要產(chǎn)區(qū)之一，主栽溫州蜜柑品種，為了研究黃龍病在溫州蜜柑果園自然入侵?jǐn)U散規(guī)律，提高監(jiān)測預(yù)警和應(yīng)急防控水平，經(jīng)濟(jì)有效控制擴(kuò)散危害，謝鐘琛等[2]和陳慈相等[3]先后對福建和江西贛南柑橘黃龍病的空間發(fā)生動(dòng)態(tài)進(jìn)行了全面研究，許長藩等[4]研究了黃龍病介體柑橘木虱傳播規(guī)律，但對黃龍病菌在溫州蜜柑植株體內(nèi)繁衍、果園自然感染時(shí)序發(fā)生規(guī)律及其擴(kuò)散模型等缺乏系統(tǒng)研究[5-7]。對此，筆者運(yùn)用病穗嫁接接種法，對感染黃龍病的溫州蜜柑植株進(jìn)行逐月抽樣和黃龍病PCR檢測，探索溫州蜜柑植株體內(nèi)黃龍病菌繁衍擴(kuò)散規(guī)律。2002—2016年在自然隔離屏障良好的溫州蜜柑果園采取定株長期跟蹤調(diào)查，探明黃龍病自然入侵?jǐn)U散規(guī)律，以期為柑橘種苗檢疫、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警和防控決策提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃龍病菌在植株體內(nèi)繁衍與擴(kuò)散測定

1.1.1 葉片黃龍病菌PCR檢測

選擇浙江柑橘黃龍病發(fā)生流行區(qū)，確定3年生溫州蜜柑發(fā)病植株5株，當(dāng)年12月集中移植在40目防蟲網(wǎng)罩內(nèi)，次年1—12月每月25日對植株進(jìn)行采樣，并進(jìn)行黃龍病PCR檢測，同時(shí)觀察記錄采樣葉片癥狀。于每株植株的東南西北中方位采同齡葉片各1張，每株5葉為1個(gè)樣品，每次采5個(gè)樣，采樣1次檢測1次，全年共采樣檢測60個(gè)樣300張葉片。

1.1.2 植株潛伏期嫁接法測定

供試種苗為1年生無病早熟溫州蜜柑、晚熟溫州蜜柑和椪柑苗木。每個(gè)品種種植7株，栽后及時(shí)搭建鋼管結(jié)構(gòu)棚，外用80目尼龍網(wǎng)罩住，防止柑橘木虱進(jìn)入，期間正常施肥用藥管理。于當(dāng)年的3月14日、3月24日分別取典型斑駁黃化癥狀的、可確診已感染黃龍病的溫州蜜柑枝條作為帶菌接穗，于離地10 cm處對供試種苗采用切腹法嫁接，每接穗具3芽保證足夠病菌，嫁接口用塑料藥膜包扎保濕，保留原植株干枝葉。接穗成活后解去塑料藥膜，及時(shí)抹除接穗上抽生的梢芽，同時(shí)保持土壤濕潤，清除雜草，肥培管理，維持接穗成活。嫁接后每隔5～7 d觀察記載各品種植株葉片黃化情況，按斑駁型、均勻黃化型和缺素黃化型做好觀察記錄，并于第2年進(jìn)行黃龍病菌PCR檢測。

1.2 植株感病與自然擴(kuò)散跟蹤

1.2.1 果園概況

選擇四面環(huán)山環(huán)水、隔離屏障良好的自然感染果園，樹齡18 a，2002年首次查見黃龍病紅鼻果。該果園為砂性紅黃壤土，土層深厚，土壤偏酸性，pH 5.5～6.5，肥力中等。

1.2.2 試驗(yàn)品種

供試品種為早熟溫州蜜柑宮川品系，種植密度900株·hm-2，單株樹冠綠葉面積一般5～6 m2，常年春梢期3—4月，夏梢期5—7月，秋梢期8—10月，掛果期5—11月。

1.2.3 處理設(shè)計(jì)

于2002—2016年確定3塊上述自然感染果園樣地，2002年供試樣地Ⅰ首次查見2株病株，樣地Ⅱ和樣地Ⅲ未查見病株，對樣地不作挖除病樹、防治柑橘木虱和補(bǔ)植枯死株空間苗木處理，任其病情自然擴(kuò)散流行。每樣地劃定500 m2方形塊，塊內(nèi)選定橘樹45株，于每年的11月上旬果實(shí)轉(zhuǎn)色成熟期，依據(jù)顯癥紅鼻果進(jìn)行調(diào)查，逐年跟蹤調(diào)查黃龍病自然發(fā)病擴(kuò)散情況。

1.3 調(diào)查統(tǒng)計(jì)

調(diào)查以株為單位記載病情級別，按年度統(tǒng)計(jì)當(dāng)年新發(fā)病率、當(dāng)年新增病指、積年發(fā)病率和積年病指等。9級病樹次年以自然死亡按減株論處，不再列入調(diào)查基數(shù)和發(fā)病樹統(tǒng)計(jì)范疇。病情分級標(biāo)準(zhǔn)為:0級，全樹無病；1級，樹冠有1～2個(gè)果枝顯癥；3級，顯癥病果枝占全樹的1/3以下；5級，顯癥病果枝占全樹的1/3以上至2/3以下；7級，顯癥病果枝占全樹2/3以上；9級，全樹死亡。

當(dāng)年新發(fā)病率(%)=當(dāng)年新增發(fā)病株數(shù)/調(diào)查樹株數(shù)×100；

當(dāng)年新增病指=∑當(dāng)年新增病樹病級之和/(調(diào)查總樹數(shù)×病級最高級)×100；

積年發(fā)病率(%)=當(dāng)年發(fā)病樹株數(shù)/調(diào)查樹株數(shù)×100；

積年病指=∑(當(dāng)年感染病樹病級總和)/(調(diào)查總樹數(shù)×病級最高級)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃龍病菌在植株體內(nèi)繁衍擴(kuò)散模型

表1顯示，當(dāng)年12月集中移植于網(wǎng)罩內(nèi)的溫州蜜柑，次年逐月進(jìn)行植株葉片黃龍病菌PCR檢測，其1—12月植株葉片黃龍病菌平均檢出率分別為48%、52%、44%、40%、88%、84%、80%、84%、96%、88%、92%和96%。表明溫州蜜柑植株體內(nèi)黃龍病菌繁衍擴(kuò)散呈Logistic模型發(fā)展軌跡，擬合后得出發(fā)病率的擴(kuò)散模型為L=101.452 2/(1+EXP(0.739 5-0.305 8 M))(df=12，P=0.001 4，r=0.875 4**)。根據(jù)模型模擬計(jì)算得出，從5%以下植株葉片檢出黃龍病菌的初次感染期，到95%以上的植株葉片感染黃龍病菌的擴(kuò)散時(shí)間為20～22個(gè)月(圖1)。

表1 柑橘黃龍病嫁接傳染與顯癥規(guī)律試驗(yàn)觀察

圖1 溫州蜜柑植株體內(nèi)黃龍病菌繁衍動(dòng)態(tài)與模擬軌跡

溫州蜜柑植株體內(nèi)黃龍病菌繁衍發(fā)展速度總體較常規(guī)細(xì)菌緩慢，一般從初次感染到植株顯癥潛伏期較長。50%左右的植株葉片感染黃龍病菌時(shí)就會(huì)表現(xiàn)葉片黃化或黃梢等癥狀。由表1可知，幼齡植株感染顯癥潛伏期短的為6個(gè)月，長的可達(dá)21個(gè)月，從感染到顯癥平均為10.5個(gè)月，與上述植株葉片黃龍病菌繁衍速度基本相似。

2.2 植株自然感病與擴(kuò)散動(dòng)態(tài)模型

2.2.1 年序新發(fā)病率變化動(dòng)態(tài)

由表2可知，2002—2016年溫州蜜柑黃龍病年序間新發(fā)病率呈波浪形曲線，3個(gè)樣地變化趨勢基本一致，1—12月當(dāng)年新發(fā)病率均值分別為1.48%、2.96%、2.96%、9.63%、10.37%、14.50%、7.75%、10.94%、8.59%、8.93%、11.65%、3.06%、2.27%、6.02%、8.22%，經(jīng)歷4個(gè)高峰后則全園發(fā)病。從首次發(fā)現(xiàn)病株后，年序新發(fā)病率漸趨上升，至第4～6年形成第1波新發(fā)病高峰，峰期2～3年，2005—2007年樣地Ⅰ新發(fā)病率分別為15.56%、11.11%和13.64%，較初始發(fā)病率增加1.5～2.5倍；2007年樣地Ⅱ新發(fā)病率16.28%，較初始發(fā)病率增2.7倍；2006—2007年樣地Ⅲ新發(fā)病率分別為13.33%和13.64%，較初始發(fā)病率增5.0～5.1倍，積年發(fā)病率均值為39.69%。第8年(2009年)形成第2波高峰，峰期為1年，即樣地Ⅰ、樣地Ⅱ和樣地Ⅲ的當(dāng)年新發(fā)病率分別為11.90%、11.90%和9.09%，較初始發(fā)病率增1.7倍、1.7倍和3.1倍，積年發(fā)病率均值為57.03%。第10～11年(2011—2012年)形成第3波高峰，峰期為1～2年，2012年樣地Ⅱ新發(fā)病率19.44%，2011—2012年樣地Ⅲ新發(fā)病率分別為14.63%、10.00%，樣地Ⅰ則不明顯，積年發(fā)病率均值達(dá)78.64%。第14～15年(2015—2016年)顯現(xiàn)翹尾峰，2016年樣地Ⅰ、樣地Ⅱ新發(fā)病率分別為11.11%、7.41%，2015—2016年樣地Ⅲ新發(fā)病率分別為9.68%、7.14%，其積年發(fā)病率均值分別為85.54%和91.78%。由于樣地Ⅰ初顯病株較樣地Ⅱ、樣地Ⅲ早1年，按初始發(fā)病顯癥年序均值統(tǒng)計(jì)，入侵第1年初始發(fā)病率為3.70%，至第4～5年上升為第1高峰，新發(fā)病率分別為11.85%和13.68%，較初始發(fā)病率增2.2～3.7倍；第7～8年為第2高峰，新發(fā)病率分別為10.10%和10.21%，較初始發(fā)病率增1.7～1.8倍；第10年新發(fā)病率為10.82%，形成第3高峰；第14～15年新發(fā)病率分別為6.44%和11.11%，出現(xiàn)尾峰后則趨向全園發(fā)病。

表2 2002—2016年溫州蜜柑果園自然感染黃龍病植株演變情況

2.2.2 年序新增病指變化動(dòng)態(tài)

由圖2可知，3個(gè)樣地溫州蜜柑黃龍病年序新增病情指數(shù)變動(dòng)趨勢表現(xiàn)一致，自入侵后5～6 a形成初次高峰后，呈現(xiàn)年升年降規(guī)律波動(dòng)，較年序新發(fā)病率曲線波動(dòng)頻率高且細(xì)致潤滑。2002年樣地Ⅰ新增病指0.99，樣地Ⅱ和樣地Ⅲ病指為0；2003年樣地Ⅰ、樣地Ⅱ和樣地Ⅲ新增病指分別是1.23、0.49和0.25；2004—2005年樣地Ⅰ新增病指分別為2.22和6.67，樣地Ⅱ?yàn)?.74和3.21，樣地Ⅲ為0和2.72；至2006—2007年快速上升形成第1高峰，樣地Ⅰ新增病指分別為10.12和10.67，樣地Ⅱ?yàn)?.94和9.30，樣地Ⅲ為4.94和5.56，調(diào)查樣地新增病指均值分別是6.67和8.49，積年病指均值為12.84和8.66。隨后各樣地年序新增病指均呈1降1升規(guī)律變化，2008—2016年新增病指均值分別為1.72、10.76、4.98、11.85、7.83、11.90、6.96、12.90和2.03，說明溫州蜜柑黃龍病從初次入侵至全園擴(kuò)散流行的最大周期為14～15 a，到2015年后樣地積年病指均值達(dá)50以上，果園嚴(yán)重感病。

圖2 溫州蜜柑黃龍病年序新增病指變化動(dòng)態(tài)

2.2.3 積年性發(fā)病擴(kuò)散動(dòng)態(tài)模型

溫州蜜柑黃龍病積年性發(fā)病擴(kuò)散主要包括病情擴(kuò)散面(當(dāng)年發(fā)病率)和嚴(yán)重度(當(dāng)年病情指數(shù))2方面，當(dāng)年積年發(fā)病率是黃龍病擴(kuò)散能力或擴(kuò)散速率指標(biāo)。圖3顯示，溫州蜜柑黃龍病積年發(fā)病率呈Logistic曲線上行走勢，其擴(kuò)散危害隨時(shí)序推進(jìn)漸趨上升，溫州蜜柑黃龍病積年發(fā)病率(Y:%)與入侵年序(N)數(shù)值化(設(shè)2002年為初始入侵年，且N=1，2，3，…，n)數(shù)學(xué)模型為:Y=87.458 5/[1+EXP(3.426 3-0.506 543N)](df=15，F(xiàn)=766.482 3，P=0.000 1，r=0.996 1**)。表明溫州蜜柑黃龍病年度間發(fā)病率隨初次感染顯癥年序遞增而擴(kuò)散，其入侵?jǐn)U散呈周期性變化規(guī)律，即無病果園一旦感病顯癥3 a后快速擴(kuò)散，至第14～15年趨向峰值，積年發(fā)病率達(dá)90%以上，此后徘徊在漸近線邊緣緩慢上升。

圖3 溫州蜜柑黃龍病積年性擴(kuò)散軌跡

溫州蜜柑黃龍病積年病指趨勢也呈Logistic曲線上行走勢，病情隨時(shí)序推進(jìn)而漸趨加重，其積年病情指數(shù)(I)與入侵年序數(shù)值化(N)數(shù)學(xué)模型為:I=59.344 1/[1+EXP(3.521 7-0.410 348N)](df=15，F(xiàn)=304.300 1，P=0.000 1，r=0.990 3**)，表明病情呈周期性變化規(guī)律，即當(dāng)無病果園一旦感病顯癥后，自第2年開始病指漸趨上升，至第14～15年病情趨向峰值，病指55以上，積年發(fā)病率90%以上，此后病情增速趨緩，在漸近線邊緣緩慢徘徊上升，發(fā)病顯癥持續(xù)14～15 a后可擴(kuò)散至整個(gè)果園。

3 小結(jié)與討論

3.1 潛伏期與體內(nèi)病菌繁衍速率相關(guān)

植株潛伏期嫁接法和黃龍病PCR測定表明，溫州蜜柑黃龍病一般在50%的植株葉片帶菌時(shí)顯癥，其體內(nèi)繁衍擴(kuò)散模型L=101.452 2/(1+EXP(0.739 5-0.305 8M)) (r=0.875 4**)，即從植株5%的葉片到95%葉片帶菌，過程所需20～22個(gè)月。與溫州蜜柑幼齡植株嫁接感染顯癥潛伏期一般短的6個(gè)月，長的21個(gè)月，平均10.5個(gè)月基本相似。

3.2 自然感病擴(kuò)散大周期14～15 a

黃龍病積年性發(fā)病流行主要受寄主、病源量、介體種群數(shù)、果園發(fā)病史和環(huán)境條件等諸多因素影響，發(fā)病至高位的時(shí)序范圍較大，有報(bào)道為3～13 a[7-8]。本研究通過長期跟蹤調(diào)查，溫州蜜柑果園初次遭受黃龍病入侵，若不加以控制自然擴(kuò)散流行，則第4～5年形成第1個(gè)高峰，其新發(fā)病率25%左右；第7～8年形成第2個(gè)高峰，新發(fā)病率20%左右；第10年形成第3個(gè)高峰，新發(fā)病率11%左右；第14～15年形成尾峰，新發(fā)病率9%左右。綜合溫州蜜柑黃龍病長期自然擴(kuò)散特征分析，14～15 a會(huì)趨向全園發(fā)病流行。

3.3 積年性擴(kuò)散呈Logistic上行曲線

溫州蜜柑黃龍病積年性發(fā)病率(Y:%)與入侵年序(N)數(shù)值化擴(kuò)散模型為Y=87.458 5/[1+EXP(3.426 3-0.506 543N)](r=0.996 1**)；積年病情指數(shù)(I)與入侵年序數(shù)值化(N)擴(kuò)散模型為I=59.344 1/[1+EXP(3.521 7-0.410 348 N)](r=0.990 3**)。由此可知，其自然入侵?jǐn)U散呈Logistic曲線上行走勢，病情指數(shù)隨時(shí)序推進(jìn)漸趨加重，表現(xiàn)周期性變化規(guī)律，即果園首次查見顯癥病株后持續(xù)14～15 a，處于徹底毀園狀態(tài)。這些規(guī)律和擴(kuò)散模型對開展柑橘類種苗檢疫和黃龍病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，以及疫情防控決策等具有重要指導(dǎo)意義。