黃 婧，趙 青，周 鵬，張 敏*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153； 2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

烏飯樹(VacciniumBracteatumThunb.)廣泛分布于我國南方各地，是蘇南丘陵山區(qū)重要的特色鄉(xiāng)土樹種[1]，作為傳統(tǒng)的食藥兩用植物，具有極大的開發(fā)利用價(jià)值。據(jù)我國歷代典籍記載與民間流傳，可用烏飯樹葉汁浸米制作烏飯、烏米糕等食品。長江以南地區(qū)有每年寒食節(jié)食用烏飯的習(xí)俗，人們認(rèn)為經(jīng)常食用可以提高免疫力、延年益壽[2]。烏飯樹的藥用歷史悠久，《中國藥典》中記載有“強(qiáng)筋身骨，益氣固精駐顏”的功效[3]。烏飯樹葉片富含黃酮類化合物[4]，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，也是當(dāng)前研究開發(fā)的熱點(diǎn)。許多研究對(duì)烏飯樹葉片黃酮類化合物的組成和含量進(jìn)行了定性定量的分析，并研究了其抗氧化、治療疾病等作用[5-9]。

為了更好地開發(fā)利用烏飯樹作為藥食同源特色林木的價(jià)值，開展烏飯樹葉片黃酮類活性成分含量的分析與評(píng)價(jià)，對(duì)不同產(chǎn)地烏飯樹葉黃酮成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，從中篩選出最佳產(chǎn)地，可以為烏飯樹資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也可為烏飯葉的黃酮化合物利用與產(chǎn)品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用試驗(yàn)材料為烏飯樹葉片，試驗(yàn)材料采自湖南白云山(中亞熱帶北緣)、安徽黃山(中亞熱帶北緣)、江西上猶(亞熱帶南緣)、江蘇溧陽(中亞熱帶北緣)、安徽宣城(中亞熱帶北緣)5個(gè)地區(qū)，于9月至次年4月每月中旬采樣，每一區(qū)域標(biāo)記健壯植株5株，每株采集當(dāng)年生枝條萌發(fā)的成熟葉片約10 g，混勻后用硅膠保存帶回實(shí)驗(yàn)室，擦拭干凈后置于烘箱，60 ℃烘至恒重，研磨至粉末狀，過60目篩，用于后續(xù)檢測。

表1 烏飯樹產(chǎn)地經(jīng)緯度

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三氯化鋁顯色法測定總黃酮含量 試驗(yàn)方法參照王立等[10]。

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱量槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，以50%乙醇溶液為溶劑配置0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，備用。取標(biāo)準(zhǔn)液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL置于25 mL容量瓶中，加入5 mL 1% AlCl3溶液和1 mL 10% NaAc溶液，用50%乙醇溶液定容。10 min后測量390 nm 處吸光度，對(duì)照為空白試劑，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到槲皮素溶液的質(zhì)量濃度X(mg/mL)與吸光度Y的線性回歸方程為Y=2.719 3X-0.001 3，R2=0.999 7。

(2)葉片黃酮提取液：精密稱取烏飯樹葉干燥粉末1.000 g，加入50%乙醇溶液20 mL，料液比為1∶20(g∶mL)，60 ℃水浴中超聲60 min(每10 min搖動(dòng)1次)，趁熱減壓過濾，50%乙醇溶液沖洗濾渣多次，濾液用50%乙醇溶液定容至25 mL。3次平行重復(fù)，取平均值。

(3)葉片黃酮含量測定：量取0.5 mL黃酮提取液，加入5 mL 1% AlCl3溶液和1 mL 10% NaAc溶液，用50%乙醇溶液定容至25 mL，10 min后測量390 nm 處吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液中黃酮含量(mg/mL)，換算成總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)。

1.2.2 高效液相色譜法測定類黃酮各成分的含量 試驗(yàn)方法參照劉知遠(yuǎn)等[11]。

(1)色譜條件：色譜柱：Eclipse Plus C18(2.1×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2% 磷酸溶液(554∶45)；流速：0.200 mL/min；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：1.0 μL；進(jìn)樣時(shí)間：10 min；柱溫：30 ℃。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別精密稱取槲皮素12 mg、木犀草素11 mg、山柰酚9 mg、芹菜素10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇-鹽酸(體積比10∶1)定容，作為儲(chǔ)備液備用；取槲皮素儲(chǔ)備液2.0 mL、木犀草素儲(chǔ)備液1.0 mL、山柰酚儲(chǔ)備液0.4 mL、芹菜素儲(chǔ)備液1.0 mL，用甲醇-鹽酸(體積比10∶1)溶液定容至50 mL，0.45 μm濾膜過濾后得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(3)樣品溶液的制備：精密稱取烏飯樹葉干燥粉末1.000 g，加入甲醇-鹽酸(體積比10∶1)混合溶液20 mL，60 ℃水浴中超聲1 h(每10 min搖動(dòng)1次)，趁熱減壓過濾，濾液用甲醇-鹽酸(體積比10∶1)溶液定容至25 mL，0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測。

(4)樣品測定：樣品的定性分析參照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定，類黃酮各成分的含量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 25進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析。以總黃酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素含量為指標(biāo)，采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法[12]對(duì)不同產(chǎn)地烏飯樹葉的營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，每個(gè)營養(yǎng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值按公式Zij=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)計(jì)算，并由此得出平均隸屬函數(shù)值。其中，Zij代表i產(chǎn)地的j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xij代表i產(chǎn)地j指標(biāo)的測定值；Ximin和Ximax分別代表各產(chǎn)地營養(yǎng)物質(zhì)指標(biāo)值的最大值和最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地烏飯樹葉中總黃酮含量差異

5個(gè)產(chǎn)地烏飯樹葉中總黃酮含量的平均值為9.964 mg/g(見圖1)，不同產(chǎn)地烏飯樹葉總黃酮含量差異極顯著(P<0.01)，其中江蘇溧陽的烏飯樹葉中總黃酮含量最高，達(dá)17.942 mg/g，其次是江西上猶和安徽宣城產(chǎn)的烏飯樹葉，其總黃酮含量分別為11.033，8.685 mg/g?？傸S酮含量最低的是湖南白云山和安徽黃山產(chǎn)的烏飯樹葉，分別為5.994，6.166 mg/g。

注：不同大寫字母表示極顯著性差異(P<0.01)。圖1 不同產(chǎn)地烏飯樹葉中總黃酮含量差異

2.2 不同產(chǎn)地烏飯樹葉中4種類黃酮成分含量差異

利用高效液相色譜儀可以同時(shí)測定出烏飯樹葉中的4種類黃酮成分，分別是槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示。

(4.273：槲皮素;5.130：木犀草素;6.959：山柰酚；7.617：芹菜素)圖2 類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品超高效液相色譜圖

5個(gè)產(chǎn)地烏飯樹葉中類黃酮各成分含量如圖3所示，5個(gè)產(chǎn)地烏飯樹葉的槲皮素含量平均值為3.126 mg/g，木犀草素含量的平均值為0.021 mg/g，山柰酚的平均含量為0.296 mg/g，芹菜素含量的平均值為0.069 mg/g，不同產(chǎn)地間各成分含量差異顯著(P<0.05)。

注：同圖中不同小寫字母表示結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05)。圖3 不同產(chǎn)地烏飯樹葉中槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素含量差異

槲皮素含量最高的烏飯樹葉產(chǎn)自江蘇溧陽，為6.490 mg/g，其次是江西上猶，其槲皮素含量為4.896 mg/g；含量最低的產(chǎn)地是安徽黃山，為0.776 mg/g；湖南白云山和安徽宣城產(chǎn)的烏飯樹葉槲皮素含量也較低，分別為1.052,2.417 mg/g。

木犀草素含量最高的烏飯樹葉同樣產(chǎn)自江蘇溧陽，達(dá)0.036 mg/g，其次是安徽宣城和江西上猶，含量分別為0.022，0.021 mg/g；含量最低的產(chǎn)地是安徽黃山，為0.012 mg/g；湖南白云山產(chǎn)的葉片木犀草素含量也較低，其值為0.016 mg/g。

江西上猶產(chǎn)的烏飯樹葉中山柰酚含量最高，達(dá)1.350 mg/g，其他地區(qū)烏飯樹葉所含的山柰酚均顯著低于江西上饒(P<0.05)，含量最低的產(chǎn)地是安徽黃山，僅為0.006 mg/g。

江蘇溧陽產(chǎn)的烏飯樹葉中芹菜素含量最高，達(dá)到0.191 mg/g，其次是江西上猶和湖南白云山產(chǎn)的烏飯樹葉，其芹菜素含量分別為0.071，0.047 mg/g；安徽宣城和安徽黃山產(chǎn)地的芹菜素含量較低。

2.3 4種類黃酮成分及總黃酮含量的相關(guān)性分析

不同產(chǎn)地烏飯樹葉槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素含量以及總黃酮含量之間的相關(guān)性分析結(jié)果如表2所示。除了山柰酚與總黃酮含量無相關(guān)性，其他3種類黃酮成分均與總黃酮呈正相關(guān)：槲皮素與總黃酮之間、芹菜素與總黃酮之間均存在著顯著的正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.956，0.946；木犀草素與總黃酮存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.962。此外，木犀草素與槲皮素存在顯著的正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.895；木犀草素與芹菜素之間存在顯著的正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.909；山柰酚與其他3種類黃酮成分均不相關(guān)。

表2 4種類黃酮成分及總黃酮含量的相關(guān)性分析

2.4 不同產(chǎn)地烏飯樹葉營養(yǎng)品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)

以烏飯樹葉中總黃酮、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素含量為指標(biāo)，采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)不同產(chǎn)地間烏飯樹葉的營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行綜合比較。平均隸屬函數(shù)值越大，說明該產(chǎn)地烏飯樹葉中的營養(yǎng)物質(zhì)含量綜合值越高，品質(zhì)越好。

由表3可以看出，江蘇溧陽產(chǎn)烏飯樹葉的平均隸屬函數(shù)值位列第一，其值為0.806；其次為江西上猶和安徽宣城產(chǎn)烏飯樹葉，平均隸屬函數(shù)值分別0.568，0.202，分別位列第二和第三；排名靠后的為湖南白云山和安徽黃山產(chǎn)烏飯樹葉，尤其是安徽黃山的烏飯樹葉平均隸屬函數(shù)值僅為0.003，排名最后。說明烏飯樹葉中總黃酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素綜合品質(zhì)最佳的產(chǎn)地為江蘇溧陽，較優(yōu)的有江西上猶和安徽宣城，較差的為湖南白云山和安徽黃山。

表3 不同產(chǎn)地烏飯樹葉4種類黃酮及總黃酮含量分析與評(píng)價(jià) mg/g

3 討論

黃酮類化合物具有很高的保健和藥用價(jià)值，是烏飯樹葉片的主要活性成分之一[4]，也是烏飯樹葉片開發(fā)利用的研究重點(diǎn)。本研究分析了不同產(chǎn)地烏飯樹葉中總黃酮含量、槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量差異，以期為烏飯樹高黃酮品種的產(chǎn)地選擇提供依據(jù)。類黃酮是一種植物次生代謝產(chǎn)物，槲皮素、木犀草素、山柰酚以及芹菜素均為天然黃酮類化合物，普遍存在于常見的可食植物中[13]。植物中總黃酮和類黃酮化合物含量的積累受到內(nèi)、外界因素的顯著影響[14]。已有研究表明，江西省內(nèi)越靠近南部產(chǎn)地的烏飯樹葉片中總黃酮含量越高[15]，湖南汨羅產(chǎn)的烏飯樹葉黃酮含量顯著高于江西南昌[16]。不同產(chǎn)地間的黃岑[17]、金銀花[18]以及紫花杜鵑[19]的類黃酮成分含量差異較大。本研究選擇湖南白云山、安徽黃山、江西上猶、江蘇溧陽、安徽宣城5個(gè)具有烏飯制作和食用傳統(tǒng)的地區(qū)作為材料源地，分析發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地烏飯樹葉中總黃酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚以及芹菜素的含量差異顯著(P<0.05)，與其他植物中的研究結(jié)果類似。烏飯樹葉中主要生物活性成分在各產(chǎn)地間存在較大程度的變異，這種變異意味著烏飯樹具有豐富的遺傳多樣性，這可能是烏飯樹自身的生理特性以及生長環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，同時(shí)這種變異也證實(shí)了進(jìn)行優(yōu)良種源的篩選有著重要的意義。

環(huán)境脅迫對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的影響或許可以解釋不同產(chǎn)地間植物類黃酮與游離氨基酸含量的差異。許多研究表明，低溫、高鹽、強(qiáng)光照、脫水等環(huán)境脅迫能夠促進(jìn)植物體內(nèi)類黃酮含量的積累[20-22]。因此，可以推測烏飯樹葉黃酮類化合物成分在各產(chǎn)地間存在較大程度的變異，可能與環(huán)境因素如溫度、光照、土壤性質(zhì)等相關(guān)，具體原因還需要開展進(jìn)一步研究。豐富的變異意味著烏飯樹具有豐富的遺傳多樣性，這可能是烏飯樹自身的生理特性以及生長環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，同時(shí)這種變異也證實(shí)了進(jìn)行優(yōu)良產(chǎn)地的篩選有著重要的意義。

模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法常被用于蔬菜營養(yǎng)品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)，張傳偉等[23]采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)25個(gè)品種(系)番茄中的優(yōu)良品質(zhì)和不良品質(zhì)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)；楊利[24]采用隸屬函數(shù)法對(duì)萱草屬(Hemerocallis)植物中的可溶性蛋白、總糖、總游離氨基酸維生素C等多個(gè)營養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。本研究采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法分別計(jì)算每個(gè)產(chǎn)地烏飯樹葉的平均隸屬函數(shù)值，從而對(duì)不同產(chǎn)地間烏飯樹葉的營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行綜合比較，江蘇溧陽產(chǎn)烏飯樹葉的平均隸屬函數(shù)值位列第一，其次為江西上猶和安徽宣城產(chǎn)烏飯樹葉，湖南白云山產(chǎn)烏飯樹葉排名第4，安徽黃山的烏飯樹葉平均隸屬函數(shù)值排名最后。因此烏飯樹葉中總黃酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素綜合品質(zhì)最佳的產(chǎn)地為江蘇溧陽，較優(yōu)的有江西上猶和安徽宣城，湖南白云山和安徽黃山的烏飯樹葉資源品質(zhì)較差。江蘇溧陽可作為優(yōu)良藥用與食用種源進(jìn)行深入開發(fā)與利用。