屈素潔，施開創(chuàng)，尹彥文，馮淑萍，陸文俊

（廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧530001）

2009年12 月，世界上首次報(bào)道在印度發(fā)現(xiàn)攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶1（new delhi metallo-βlactamase-1，NDM-1）、具有超強(qiáng)耐藥性的肺炎克雷伯氏菌，除對(duì)替加環(huán)素和多粘菌素敏感外，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類及喹諾酮類的多種抗菌藥物均具有耐藥性[1]。此后，這種耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”陸續(xù)在巴爾干半島各國(guó)、美國(guó)、加拿大、荷蘭、中國(guó)等國(guó)家被報(bào)道，呈世界性分布[2-3]。目前，攜帶blaNDM-1基因的細(xì)菌分布廣泛，主要發(fā)現(xiàn)于腸桿菌科的大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、沙門氏菌以及莫拉菌科的鮑曼不動(dòng)桿菌、索氏志賀菌等[3-4]。2016年，我國(guó)科學(xué)家在世界上首次從來自養(yǎng)殖場(chǎng)的大腸桿菌分離株中發(fā)現(xiàn)黏菌素耐藥基因mcr-1基因[5]，證實(shí)其編碼的MCR-1蛋白具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶活性，可催化磷酸乙醇胺與脂多糖表面類脂A結(jié)合，介導(dǎo)黏菌素耐藥。此后，在丹麥、泰國(guó)、尼日利亞、法國(guó)、英國(guó)、加拿大、美國(guó)、德國(guó)、突尼斯、日本、越南等國(guó)家也有相關(guān)報(bào)道被相繼發(fā)表[4,6]。同時(shí)攜帶blaNDM-1基因和mcr-1基因的大腸桿菌、陰溝腸桿菌、無丙二酸枸櫞酸桿菌等[7-9]，加上blaNDM-1基因和mcr-1基因均可通過質(zhì)粒在相同和不同菌種間水平和垂直傳播[10-11]，使得臨床致病菌的耐藥性和多重耐藥性問題日益嚴(yán)重，給臨床醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)及食品安全等帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，加強(qiáng)對(duì)攜帶blaNDM-1基因和mcr-1基因細(xì)菌的監(jiān)測(cè)和防控尤為重要。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者針對(duì)blaNDM-1基因和mcr-1基因檢測(cè)已研究建立了不少快速檢測(cè)方法，其中針對(duì)blaNDM-1基因主要有普通PCR、TaqMan熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基因芯片技術(shù)等[12-15]，針對(duì)mcr-1基因主要有普通PCR、TaqMan熒光定量PCR、SYBR Green熒光定量PCR、LAMP等[16-19]，但迄今未見同時(shí)檢測(cè)blaNDM-1基因和mcr-1基因的快速檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。本研究以blaNDM-1基因和mcr-1基因?yàn)榘谢?，分別設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，通過優(yōu)化各種反應(yīng)條件，成功建立了同時(shí)檢測(cè)blaNDM-1基因和mcr-1基因的雙重TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，為臨床監(jiān)測(cè)blaNDM-1基因和mcr-1基因攜帶菌提供了有效的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株雞白痢沙門氏菌（CVCC538）、大腸桿菌（ATCC25922）、多殺性巴氏桿菌（CVCC386）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）標(biāo)準(zhǔn)株均購自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌毒種保藏中心；肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株由廣西大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)教研室提供；55株雞源致病性沙門氏菌分離株由本中心實(shí)驗(yàn)室于2014-2017年分離、鑒定和保存[20]；10株生鮮畜禽產(chǎn)品源大腸桿菌分離株由廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌病研究室提供[21]。

1.2 主要試劑Mini Plasmid Kit質(zhì)粒提取試劑盒、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction試劑盒、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction核酸抽提試劑盒、EcoR Ⅰ內(nèi)切酶、Hind III內(nèi)切酶、pMD18-T載體、Premix ExTaqTM（Probe qPCR）熒光定量試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物與探針設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的blaNDM-1基因（GenBank登錄號(hào)：FN396876）和mcr-1基因（GenBank登錄號(hào)：KP347127）序列，針對(duì)blaNDM-1～blaNDM-12基因和mcr-1～mcr-8基因的保守區(qū)域，采用Primer Express 3.0軟件，分別設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針（表1）。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建根據(jù)blaNDM-1基因和mcr-1基因保守序列，體外分別合成保守區(qū)域126 bp和107 bp的單鏈DNA片段。以此為模板，分別利用引物對(duì)NDM-F/R、mcr-F/R進(jìn)行擴(kuò)增，獲得blaNDM-1基因126 bp和mcr-1基因107 bp目的片段，PCR回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆增菌后提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為p-NDM-1和p-mcr-1，作為本研究的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)Raymond報(bào)道的方法[22]計(jì)算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)，即先用核酸蛋白分析儀測(cè)定D260，計(jì)算質(zhì)粒濃度，然后換算成拷貝數(shù)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度×6.02×1023/（660×質(zhì)?？傞L(zhǎng)度）

表1 本研究所用引物和探針Table 1 Primers and TaqMan probes used in this study

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將2種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-NDM-1、p-mcr-1作為模板，應(yīng)用2對(duì)特異性引物和TaqMan探針，在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行雙重TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增，優(yōu)化各種反應(yīng)條件。建立總體積為20 μL的多重反應(yīng)體系，分別對(duì)退火溫度（52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃）、引物濃度（25 pmol/μL引物0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL）和探針濃度（25 pmol/μL探針0.1 μL、0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL）進(jìn)行優(yōu)化，以獲得TaqMan熒光定量PCR的最佳反應(yīng)條件。將2種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋成1.63×102～1.63×108拷貝/μL，作為模板，按照優(yōu)化的TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)以從大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株提取的基因組DNA為模板，以制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對(duì)照、滅菌ddH2O為陰性對(duì)照，在優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)品p-NDM-1、p-mcr-1進(jìn)行1 0倍系列稀釋，等比例混合成濃度為1.63×101～1.63×107拷貝/μL。以此為模板，根據(jù)已優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR，分析其敏感性。同時(shí)，以引物對(duì)NDM-F/R、mcr-F/R進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，與所建立的雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行敏感性比較。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-NDM-1、p-mcr-1進(jìn)行10倍系列稀釋，等比例混合，取3個(gè)濃度梯度1.63×103、1.63×104、1.63×105拷貝/μL為模板，進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.9 臨床樣品檢測(cè)將本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定、保存的55株雞源致病性沙門氏菌以及廣西獸醫(yī)研究所提供的10株生鮮畜禽產(chǎn)品源大腸桿菌分離株進(jìn)行復(fù)蘇、增菌培養(yǎng)，提取總DNA。應(yīng)用所建立的雙重?zé)晒舛縋CR，檢測(cè)blaNDM-1基因和mcr-1基因。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建分別以合成的單鏈DNA為模板，利用引物對(duì)NDM-F/R、mcr-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小一致的126 bp、107 bp目的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化，陽性克隆增菌后提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定，證明成功構(gòu)建了2種重組質(zhì)粒，分別命名為p-NDM-1、p-mcr-1（圖1）。將重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定質(zhì)粒濃度，并換算成拷貝數(shù)。

圖1 重組質(zhì)粒p-NDM-1（A）和p-mcr-1（B）的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid p-NDM-1(A) and p-mcr-1 (B)

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果經(jīng)過對(duì)退火溫度、引物濃度、探針濃度等條件進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)和優(yōu)化，獲得雙重?zé)晒舛縋CR最佳反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Premix ExTaqTM（Perfect real time）10 μL，Rox參比染料（50×）0.2 μL，NDM-F/R和mcr-F/R上、下游引物（25 pmol/μL）各0.6 μL，NDM-P和mcr-P探針（25 pmol/μL）各0.4 μL，模板2.0 μL，滅菌ddH2O 4.4 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，56℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光信號(hào)。

2.3 雙重?zé)晒舛縋CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以等比例混合的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-NDM-1、p-mcr-1 10倍系列稀釋成1.63×102～1.63×108拷貝/μL為模板，按照優(yōu)化的雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制擴(kuò)增曲線（圖2A）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2B）。結(jié)果，兩種質(zhì)粒起始模板量與Ct值之間存在良好的線性關(guān)系，p-NDM-1和p-mcr-1的相關(guān)系數(shù)R2分別為1和0.99。

2.4 特異性試驗(yàn)以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以及大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌總DNA為模板，進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。結(jié)果，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-NDM-1和p-mcr-1出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，而以其他細(xì)菌DNA為模板時(shí)無擴(kuò)增曲線，表明所建立的雙重?zé)晒舛縋CR具有很強(qiáng)的特異性（圖3）。

2.5 敏感性試驗(yàn)以濃度為1.63×101～1.63×107拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-NDM-1、p-mcr-1為模板，進(jìn)行熒光定量PCR和普通PCR。結(jié)果顯示，雙重?zé)晒舛縋CR檢出下限均為1.63×101拷貝/μL（圖4），普通PCR檢出下限均為1.63×103拷貝/μL（圖5），雙重?zé)晒舛縋CR比普通PCR敏感性高100倍。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)以等比例混合的濃度為1.63×103、1.63×104、1.63×105拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-NDM-1、p-mcr-1為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為0.58%～1.90%，均小于2%（表2），具有良好的重復(fù)性。

圖2 雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增曲線（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.2 Dynamic curves (A) and standard curves (B) of the duplex real-time PCR

圖3 雙重?zé)晒舛縋CR特異性試驗(yàn)Fig.3 The specificity test of the duplex real-time PCR

圖4 雙重?zé)晒舛縋CR敏感性試驗(yàn)Fig.4 The sensitivity test of the duplex real-time PCR

2.7 臨床樣品檢測(cè)應(yīng)用本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR，對(duì)55株于2014-2017年采自廣西的雞源致病性沙門氏菌分離株、10株2015-2016年采自廣西的生鮮畜禽產(chǎn)品源大腸桿菌分離株進(jìn)行blaNDM-1基因和mcr-1基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，在55株沙門氏菌分離株中均未檢測(cè)到攜帶blaNDM-1基因和mcr-1基因（圖6），在10株大腸桿菌分離株中檢測(cè)到2株攜帶blaNDM-1基因、1株攜帶mcr-1基因（圖7），未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶2種基因的分離株。

圖5 普通PCR敏感性試驗(yàn)Fig.5 The sensitivity test of the conventional PCR

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)超級(jí)細(xì)菌攜帶blaNDM-1基因和mcr-1基因以來，該現(xiàn)象引起全世界范圍內(nèi)的高度關(guān)注。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者針對(duì)blaNDM-1基因[12-15]、mcr-1基因[16-19]研究建立了普通PCR、TaqMan熒光定量PCR、SYBR Green熒光定量PCR、LAMP等快速檢測(cè)方法，但上述方法均只針對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，迄今未見同時(shí)檢測(cè)blaNDM-1基因和mcr-1基因的快速檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。本研究針對(duì)blaNDM-1基因及其變異體（blaNDM-2～blaNDM-12）[23]、mcr-1基因及其變異體（mcr-2～mcr-8）[24]序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物和2條TaqMan探針，以構(gòu)建的含有blaNDM-1基因和mcr-1基因片段的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，通過優(yōu)化各種反應(yīng)條件，首次成功建立了同時(shí)檢測(cè)blaNDM-1基因和mcr-1基因的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便、高通量、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于blaNDM-1基因和mcr-1基因的臨床監(jiān)測(cè)和檢測(cè)。

表2 雙重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性分析Table 2 Reproducibility assay of the duplex real-time PCR

圖6 沙門氏菌分離株的檢測(cè)結(jié)果Fig.6 The detection results of Salmonella isolates

圖7 大腸桿菌分離株的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The detection results of Escherichia coli isolates

迄今，發(fā)現(xiàn)攜帶blaNDM-1基因的細(xì)菌主要是大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、沙門氏菌等[3,25]，攜帶mcr-1基因的細(xì)菌主要是大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌和阪崎腸桿菌等[4,26]。其中，沙門氏菌、大腸桿菌作為主要的人畜共患病原菌，是blaNDM-1基因和mcr-1基因的重要攜帶者，但不同地域、不同時(shí)間的檢測(cè)陽性率有所差異。在攜帶blaNDM-1基因方面，2013-2015年，Hu等[27]從中國(guó)8個(gè)城市分離的1162株人源細(xì)菌檢測(cè)blaNDM-1基因，結(jié)果顯示45株為陽性（3.9%，45/1162），其中大腸桿菌14株（31.1%，14/45）、肺炎克雷伯氏菌12株（26.7%，12/45）、醋酸鈣不動(dòng)桿菌9株（20.0%，9/45）、腸炎沙門氏菌4株（8.9%，3/45）、陰溝腸桿菌3株（6.7%，3/45）以及鼠傷寒沙門菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌各1株（2.2%，1/45）。鮮少有關(guān)于動(dòng)物源沙門氏菌攜帶blaNDM-1基因比例情況的報(bào)道。在攜帶mcr-1基因方面，2002-2015年，Campos等[28]對(duì)來自葡萄牙的1010株人源、豬源沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，分離株均能檢測(cè)到mcr-1基因，其中人源分離株陽性率為0.8%（4/522）、豬源分離株陽性率為2.4%（7/296）。2012-2015年，Carnevali等[29]對(duì)來自意大利的4437株沙門氏菌分離株（人源3294株、動(dòng)物源1143株）進(jìn)行mcr-1基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，人源分離株陽性率為0.3%（10/3294），動(dòng)物源分離株陽性率為1.3%（15/1143）。2013-2014年，Yi等[30]對(duì)我國(guó)華南和華中地區(qū)屠宰場(chǎng)分離的142株豬源沙門菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mcr-1基因檢出率為14.8%（21/142）。張榮民[31]從肉雞產(chǎn)業(yè)鏈條（種雞場(chǎng)-商品雞場(chǎng)-肉雞屠宰場(chǎng)-超市）中收集雞、狗、家燕、養(yǎng)殖人員糞便以及污水和蒼蠅共739份樣本中分離到161株大腸桿菌、55株肺炎克雷伯菌、29株陰溝腸桿菌共245株（33.2%，245/739）碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌，均呈blaNDM-1基因陽性，其中37株大腸桿菌同時(shí)攜帶mcr-1基因。2014-2016年，張純萍等[32]對(duì)來自我國(guó)12個(gè)省的450株雞源沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，未檢測(cè)出mcr-1基因陽性的沙門氏菌。本研究中的55株雞源致病性沙門氏菌，對(duì)苯唑西林、阿莫西林、鏈霉素、磺胺甲惡唑、四環(huán)素和呋喃妥因等多種抗菌素多重耐藥[20]，對(duì)多粘菌素E的耐藥率為98.18%（54/55），但未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶blaNDM-1基因和mcr-1基因的分離株，這可能是除了blaNDM-1基因和mcr-1基因，還有其他基因影響細(xì)菌對(duì)多粘菌素的耐藥，此原因有待進(jìn)一步研究。而本研究中的10株大腸桿菌已對(duì)多種抗菌藥物具有耐藥性（主要集中在12～18重耐藥）[21]，其中有2株分離株攜帶blaNDM-1基因、1株分離株攜帶mcr-1基因，該結(jié)果提示我們要高度重視生鮮畜禽產(chǎn)品的細(xì)菌耐藥問題。同時(shí)，要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，必要時(shí)應(yīng)擴(kuò)大監(jiān)測(cè)面、增加監(jiān)測(cè)量，以切實(shí)做好耐藥細(xì)菌的監(jiān)測(cè)和防范。

總之，本研究成功建立了同時(shí)檢測(cè)blaNDM-1基因和mcr-1基因的雙重TaqMan熒光定量PCR方法，為臨床監(jiān)測(cè)攜帶blaNDM-1基因和mcr-1基因的超強(qiáng)耐藥菌提供了一種快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異的技術(shù)手段。