王 璐，朱順海，趙其平，黃 兵，韓紅玉，劉桂玲,2，李志行,2，趙煥之，董 輝

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

雞球蟲病是由艾美耳屬（Eimeriaspp.）球蟲引起的一種廣泛流行的寄生蟲病，每年給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，控制球蟲病的方法主要是使用抗球蟲藥物或疫苗，但廣泛使用抗球蟲藥已導(dǎo)致雞體產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性[2]，疫苗因成本較高且存在毒力反強(qiáng)等問題而使其使用受限[3]。因此，迫切需要研究新的方法來控制雞球蟲病。柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）是7種雞艾美耳球蟲中的一員[4]，具有很強(qiáng)的致病力。柔嫩艾美耳球蟲屬于嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)專性寄生蟲，有著復(fù)雜的生活史，必須依靠宿主細(xì)胞才能完成其生活周期。阻止蟲體入侵細(xì)胞和在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育是預(yù)防和控制球蟲病的有效方法。因此，鑒定與蟲體入侵相關(guān)的關(guān)鍵分子將有助于開發(fā)新的抗球蟲藥物和疫苗。

寄生蟲感染細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，其間宿主細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列的反應(yīng)以抵抗寄生蟲的入侵與發(fā)育，同時(shí)，蟲體也會(huì)調(diào)控宿主細(xì)胞的某些機(jī)能活動(dòng)以創(chuàng)造更利于自身發(fā)育和繁殖的條件。已有研究表明，感染鐮形艾美耳球蟲（E. falciformis）后，小鼠上皮細(xì)胞中吲哚胺2,3-雙加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase1）的表達(dá)會(huì)顯著增加，并且這一現(xiàn)象會(huì)在寄生蟲感染過程中持續(xù)存在，升高的吲哚胺2,3-雙加氧酶1對(duì)維持寄生蟲最佳發(fā)育有重要作用[5]。在微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）的感染過程中，宿主細(xì)胞整合素α2（integrin α2）可能作為感染部位F肌動(dòng)蛋白上游調(diào)控元件的一部分，與蟲體發(fā)生相互作用[6]。以上研究表明，宿主細(xì)胞在寄生蟲入侵和細(xì)胞內(nèi)發(fā)育中起著不可或缺的作用。目前，艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的研究主要集中在蟲體蛋白上，而與艾美耳球蟲相關(guān)的宿主蛋白研究鮮有報(bào)道。

相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)已經(jīng)成為一種強(qiáng)有力的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，如定量準(zhǔn)確、高效率樣品分離、高鑒定率、適用范圍廣等，該技術(shù)已成功應(yīng)用于探索病毒[7]和細(xì)菌[8]與宿主相互作用機(jī)制的研究。本研究運(yùn)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)，對(duì)原代雞胚成纖維（chicken embryo fibroblast，CEF）細(xì)胞在柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵72 h后的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了篩選，為深入研究柔嫩艾美耳球蟲與宿主之間的互作關(guān)系提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物柔嫩艾美耳球蟲上海株（資源編號(hào)：CAAS21111611），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲病團(tuán)隊(duì)保存。三黃雞購自上海某雞場(chǎng)，無球蟲的條件下飼養(yǎng)，飼料和飲水中不添加任何抗球蟲藥物。

1.2 試劑和儀器PBS溶液、DMEM、胰蛋白酶、SDT裂解液購自美國Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀、Easy nLC1000納升級(jí)液相色譜儀購自美國Thermo Finnigan公司；AKTA Purifier 100純化儀購自GE Healthcare；低溫高速離心機(jī)、真空離心濃縮儀購自美國Eppendorf公司；可見紫外分光光度計(jì)購自尤尼柯公司；600 V電泳儀（GE Healthcare EPS601）購自Manuale公司。

1.3 CEF細(xì)胞制備按照Witter等[9]的方法進(jìn)行CEF細(xì)胞的制備，具體步驟為：取10日齡SPF雞胚3只，去除頭、四肢、內(nèi)臟等部分，取肌肉組織，預(yù)冷PBS沖洗3次，充分剪碎至肉糜狀，預(yù)冷PBS重懸后，3000×g離心10 min，棄上清液，重復(fù)此步驟。沉淀用預(yù)冷DMEM重懸后，3000×g離心10 min，棄上清液，加入0.25%胰蛋白酶15 mL，37℃消化1 h，期間每20 min震蕩混勻1次。消化后100 μm濾膜過濾，濾液中加入完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%雙抗）后，3000×g離心10 min，棄上清液，重復(fù)1次，用適量完全培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞沉淀后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 柔嫩艾美耳球蟲卵囊的收集、純化及子孢子的提取1日齡三黃雞在無球蟲的條件下飼養(yǎng)至14日齡后，接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，每只接種2.0×104個(gè)卵囊。收集接種后6～8 d雞糞便中的卵囊，通氧至卵囊孢子化率達(dá)90%左右時(shí)，用飽和食鹽水飄浮法和次氯酸鈉法對(duì)孢子化的卵囊進(jìn)行純化。在純化好的孢子化卵囊沉淀中加入PBS，用玻璃珠震蕩破壁至卵囊破壁率達(dá)到90%，3000×g離心8 min，用HBBS緩沖液重懸沉淀后，轉(zhuǎn)移至錐形瓶?jī)?nèi)，向其中加入0.5%的胰蛋白酶和7%的雞膽汁，吸管輕輕吹打后在41℃水浴鍋中消化約1 h，鏡檢若有大部分子孢子釋放出來時(shí)，離心、洗滌，用G3砂芯漏斗純化子孢子。收集濾液，子孢子沉淀用PBS洗滌3次后，計(jì)數(shù)。

1.5 入侵實(shí)驗(yàn)CEF細(xì)胞（1.5×106個(gè)細(xì)胞/瓶）接入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基37℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%左右。新鮮子孢子在DMEM（含2%血清、5%雙抗）中37℃、5%CO2孵育2 h，3500×g離心10 min，棄上清液，完全培養(yǎng)基重懸后，按子孢子與細(xì)胞2∶1比例接入細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，以洗去未入侵的子孢子，繼續(xù)培養(yǎng)60 h。設(shè)置不加入子孢子的細(xì)胞為對(duì)照組。所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 樣品的收集與細(xì)胞全蛋白的提取收集子孢子入侵72 h和不入侵的細(xì)胞樣品，預(yù)冷PBS洗3次，加入SDT（4% SDS、1 mmol/L DTT、150 mmol/L Tris-HCl pH8.0、蛋白酶抑制劑）裂解液，勻漿均勻后，進(jìn)行超聲和沸水浴裂解，4℃、15 000×g離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，低溫保存。

1.7 酶解、肽段定量和標(biāo)記各取200 μg樣品，加入200 μL UA buffer（8 mol/L尿素，150 mmol/L Tris-HCl pH8.0）混勻后加入超濾離心管，14 000×g離心15 min。再加入200 μL UA buffer 14 000×g離心15 min，棄濾液。加入100 μL IAA（50 mmol/L IAA in UA），600 rpm振蕩1 min，避光室溫孵育30 min，14 000×g離心10 min。加入100 μL UA buffer，14 000×g離心10 min，重復(fù)2次。加入100 μL Dissolution buffer，14 000×g離心10 min，重復(fù)2次。加入40 μL Trypsin buffer（2 μg Trypsin in 40 μL Dissolution buffer），600×g振蕩1 min，37℃孵育16 h進(jìn)行酶解。14 000 ×g離心10 min，取濾液，D280肽段定量[10]。各組樣品肽段分別取80 μg，按照AB SCIEX公司iTRAQ Reagent-8plex Multiplex試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記分組如下：實(shí)驗(yàn)1-113、實(shí)驗(yàn)2-114、實(shí)驗(yàn)3-115、對(duì)照1-116、對(duì)照2-117、對(duì)照3-118。

1.8 SCX分級(jí)使用AKTA Purifier 100（GE Healthcare）和層析柱Polysulfoethyl 4.6×100 mm column（5 μm、200?）（PolyLCInc, Maryland,U.S.A）對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理。將標(biāo)記后的所有肽段混合，進(jìn)行SCX預(yù)分級(jí)。SCX分級(jí)后，收集洗脫36份fraction，根據(jù)SCX色譜圖合并成15份，凍干后C18 Cartridge（Sigma）脫鹽。

1.9 質(zhì)譜分析每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。色譜柱用95%的A液（0.1%甲酸水溶液）平衡后，樣品加至上樣柱Thermo scientific EASY column（2 cm×100 μm 5μm-C18），再經(jīng)分析柱Thermo scientific EASY column（75 μm×100 mm 3 μm-C18）分離，流速為300 nL/min。相關(guān)液相梯度如下：0 min～50 min，B液（0.1%甲酸，84%乙腈水溶液）線性梯度從0%到40%；50 min～58 min，B液線性梯度從40%到100%；58 min～60 min，B液維持在100%。

經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后的樣品用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長：60 min；檢測(cè)方式：正離子；母離子掃描范圍：300-1800 m/z；一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000 at m/z 200；AGC target：3e6，一級(jí)Maximum IT：10 ms；Number of scan ranges ：1，Dynamic exclusion：40.0 s。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比采集方法：每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）；MS2 Activation Type：HCD；Isolation window：2 m/z；二級(jí)質(zhì)譜分辨率：17 500 at m/z 200；Microscans：1；二級(jí)Maximum IT：60 ms；Normalized collision energy：30 eV；Underfill ratio：0.1%。

1.10 數(shù)據(jù)分析用軟件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4（thermo）進(jìn)行查庫鑒定及定量分析。使用數(shù)據(jù)庫：uniprot_gallus_gallus_36088_20170518.fasta（蛋白質(zhì)序列：36 088條；下載日期：20170518）。

1.11 生物信息學(xué)分析根據(jù)蛋白質(zhì)的豐度水平，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異倍數(shù)＞1.3 or ＜0.77，且p＜0.05[11-12]時(shí)，認(rèn)定為差異蛋白，結(jié)合Gene ontologv（http://www.geneontologv.org/）、KEGG、STRING、uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO注釋及代謝通路分析。運(yùn)用顯著性差異檢驗(yàn)方法，用COG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異蛋白質(zhì)富集的GO條目以及顯著性富集的Pathway進(jìn)行比對(duì)，對(duì)這些蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分析。

1.12 qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白收集子孢子感染72 h和未感染的細(xì)胞樣品，用Trizol試劑按說明書提取細(xì)胞總RNA。使用DNaseI去除總RNA中基因組DNA，參照RNeasy? Mini Kit說明書對(duì)總RNA進(jìn)行純化，用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，用QIA quick? PCR試劑盒純化cDNA。本次試驗(yàn)

以β-actin作為內(nèi)參，共檢測(cè)10個(gè)基因，引物信息見表1。按照TaKaRa熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)操作，反應(yīng)體系：cDNA（1 μL）、SYBRR Premix Dimer Eraser（2×）（10 μL）、ROX Reference DyeⅡ（1μL）、無RNase水（7.2 μL）和10 mmol/L正向和反向引物（各0.4 μL）。用Q5熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，第一階段：預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)，95℃30 s；第二階段：40個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s，60℃ 30 s；第三階段：溶解曲線。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按照公式：ΔΔCt=（Ct目的RNA-Ct內(nèi)參）處理組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參）對(duì)照組）對(duì)目的基因mRNA的Ct值作轉(zhuǎn)換，表示試驗(yàn)組表達(dá)量于對(duì)照組的倍數(shù)改變。用SPASS 21.0對(duì)其進(jìn)行比較，P值為0.05。

1.13 Western blot驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白子孢子感染72 h和未感染的細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次，然后加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，最后收集細(xì)胞裂解液，4℃、12 000×g15 min，收集上清液即蛋白。BCA法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度，以β-actin為參照調(diào)整蛋白樣品上樣量。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂乳（PBS稀釋）4℃封閉12 h，PBST洗滌3次，加入兔FABP4抗體（1∶200稀釋，本實(shí)驗(yàn)室制備），37℃孵育2 h，經(jīng)洗滌加入熒光二抗（1∶5000），孵育1 h后，PBST洗滌4次，再經(jīng)PBS洗滌1次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)成像，Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。

表1 熒光定量PCR的特異性引物序列Table 1 Sequences of gene-specific primers for qPCR assays

2.結(jié)果

2.1 差異蛋白的鑒定通過對(duì)原始數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計(jì)，共定量到23 614個(gè)唯一肽段和3 967個(gè)蛋白質(zhì)。將感染組和對(duì)照組進(jìn)行比較，差異倍數(shù)≥1.3或≤0.7且P<0.05視為有差異[13]，共鑒定到259個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白145個(gè)，下調(diào)蛋白114個(gè)。下調(diào)最為明顯的5個(gè)差異蛋白包括脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、Staufen雙鏈RNA結(jié)合蛋白2（STAU2）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（TOP3A）、組蛋白1（H1）、起始識(shí)別復(fù)合物亞基5（ORC5）；上調(diào)最為明顯的5個(gè)蛋白包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、DEAD box解旋酶20（DDX20）、Wnt家族復(fù)合物2B（WNT2B）和2個(gè)未知蛋白，詳見表2。這表明蟲體的入侵和發(fā)育會(huì)引起CEF細(xì)胞發(fā)生一系列蛋白質(zhì)組的變化從而應(yīng)對(duì)蟲體的感染。

表2 前5個(gè)下調(diào)和上調(diào)差異表達(dá)蛋白Table 2 The top five down-regulate and up-regulate differentially expressed proteins

2.2 生物信息學(xué)分析GO分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程（biological process）方面，差異蛋白主要富集在細(xì)胞內(nèi)過程（cellular process）15%、單一生物過程（single-organism process）13%、代謝過程（metabolic process）12%、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）10%等（圖1A），說明蟲體感染會(huì)使宿主細(xì)胞發(fā)生一系列的生物過程。在細(xì)胞內(nèi)組分（cellular component）方面，差異蛋白主要富集在細(xì)胞（cell）18%、細(xì)胞部分（cell part）17%、細(xì)胞器（organelle）16%、細(xì)胞器部分（organelle part）8%、膜（membrane）8%等（圖1B）。在分子功能（molecular function）方面，差異蛋白主要富集在結(jié)合（binding）52%、催化活性（catalytic activity）29%、轉(zhuǎn)運(yùn)子活性（transporter activity）4%等（圖1C）。

KEGG通路分析表明，差異蛋白富集到的通路主要有細(xì)胞外基質(zhì)受體互作（E M C-receptor interaction）、糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogensis）、粘著斑（focal adhesion）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）等（圖2）。

2.3 qPCR驗(yàn)證差異蛋白使用qPCR的方法檢測(cè)了10個(gè)差異基因的mRNA水平變化。結(jié)果顯示：ALDH1A2、MAP1B、MMP2、RPS27A、CNBP、MAEA、CD164、GAPDH等8個(gè)基因的mRNA水平變化與iTRAQ結(jié)果中蛋白水平變化相一致，而FABP4和TOP3A 2個(gè)基因的mRNA水平變化與iTRAQ結(jié)果中蛋白水平變化不一致。

2.4 Western blot驗(yàn)證差異蛋白用Western blot方法對(duì)差異蛋白FABP4在蛋白水平進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示：與未感染組相比，子孢子感染72 h組細(xì)胞FABP4的表達(dá)量顯著降低（圖3），與iTRAQ的結(jié)果保持一致。

3 討論

圖1 柔嫩艾美耳球蟲感染CEF細(xì)胞后259個(gè)差異表達(dá)蛋白的GO分析Fig.1 Gene ontology analysis of 259 proteins differentially expressed in CEF cells infected with Eimeria tenella

圖2 富集的前10個(gè)KEGG通路Fig.2 Top 10 enriched KEGG processes

越來越多的證據(jù)表明，宿主細(xì)胞提供了球蟲子孢子與宿主細(xì)胞識(shí)別和相互作用的前提條件[14]，所以研究子孢子感染后的宿主差異表達(dá)蛋白對(duì)探究艾美耳球蟲的感染機(jī)制有重大意義。本研究利用iTRAQ技術(shù)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子感染72 h的CEF細(xì)胞和未感染的CEF細(xì)胞之間的差異蛋白進(jìn)行了篩選。選取CEF細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，CEF細(xì)胞為雞胚原代成纖維細(xì)胞，原代細(xì)胞比其它傳代細(xì)胞更加適于蟲體的入侵和發(fā)育，并且該細(xì)胞來源于雞更貼近體內(nèi)真實(shí)感染情況。我們共獲得了259個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白145個(gè)，下調(diào)蛋白114個(gè)。利用qPCR檢測(cè)了10個(gè)差異蛋白在球蟲感染后細(xì)胞的mRNA水平變化，以驗(yàn)證iTRAQ結(jié)果的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因的結(jié)果與iTRAQ的一致，而FABP4和TOP3A的結(jié)果不一致。利用Western blot對(duì)FABP4在球蟲感染細(xì)胞中的蛋白水平變化，結(jié)果與iTRAQ的保持一致。驗(yàn)證的結(jié)果表明大多數(shù)差異表達(dá)蛋白的調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平上直接進(jìn)行的，但也有少量蛋白的表達(dá)水平與其基因轉(zhuǎn)錄水平不匹配，原因在于蛋白的豐度不僅取決于轉(zhuǎn)錄水平，還取決于翻譯后修飾[15]。為了分析差異蛋白在球蟲感染中的作用，將它們分為刺激和防御（stress and defense）、免疫反應(yīng)（immune response）、代謝（metabolism）和凋亡（apoptosis）4個(gè)方面進(jìn)行討論。

當(dāng)受到寄生蟲感染時(shí)，宿主細(xì)胞的皮膚或粘膜屏障、天然免疫系統(tǒng)、抗寄生蟲特異性免疫機(jī)制等會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化以抵抗蟲體的入侵。例如，腸上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生許多抗微生物多肽作為天然免疫的一部分以抵抗隱孢子蟲的感染[16]。惡性瘧原蟲可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞IFN-β mRNA和蛋白的高表達(dá)[17]。本研究篩選出了一些與宿主應(yīng)激和防御相關(guān)的差異蛋白，其中干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）在子孢子感染后明顯上調(diào)（感染組/未感染組比值1.40），IRF3主要負(fù)責(zé)干擾素-β（IFN-β）的誘導(dǎo)，對(duì)干擾素反應(yīng)的激活有著重要作用[18]，其在天然免疫和適應(yīng)性免疫的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[19]。因此我們推測(cè)這些與刺激和防御相關(guān)的差異蛋白在宿主抵抗艾美耳球蟲感染方面發(fā)揮重要作用。

表3 差異表達(dá)蛋白的qRT-PCR驗(yàn)證Table 3 Verification of differently expressed proteins by qRT-PCR

圖3 差異表達(dá)蛋白的Western blot驗(yàn)證Fig.3 Verification of differently expressed proteins by Western blot

宿主感染寄生蟲后可通過不同的免疫機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體免疫保護(hù)以清除蟲體。例如，隱孢子蟲感染宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生趨化因子來清除并殺死隱孢子蟲[20]。同時(shí)，寄生蟲也擁有強(qiáng)大而多變的免疫扭轉(zhuǎn)策略，能夠逃避宿主免疫攻擊，造成宿主持續(xù)性感染[21]。Mangan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，曼氏血吸蟲感染后可誘導(dǎo)IL-10 B細(xì)胞增加，保護(hù)小鼠抵抗實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的系統(tǒng)性過敏反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，子孢子感染后自噬相關(guān)蛋白5（ATG5）呈明顯下調(diào)表達(dá)（感染組/未感染組比值0.66），ATG5在自噬泡的形成過程中起重要作用[23]，并具有促凋亡活性[24]，這與本研究發(fā)現(xiàn)子孢子感染后Caspase-3呈下調(diào)表達(dá)結(jié)果一致。在原代巨噬細(xì)胞中，干擾素（IFN-γ）/LPS破壞剛地弓形蟲寄生液泡膜和寄生蟲清除時(shí)需要ATG5的參與[25]。我們推測(cè)，在球蟲子孢子感染宿主細(xì)胞后，蟲體會(huì)抑制宿主細(xì)胞ATG5產(chǎn)生，以防止被宿主清除。

頂復(fù)門原蟲需要從宿主細(xì)胞內(nèi)獲取營養(yǎng)物質(zhì)來維持自身的發(fā)育和增殖[26]。本試驗(yàn)所鑒定出的與代謝相關(guān)的通路主要有脂質(zhì)代謝通路、氨基酸合成通路、核苷酸合成代謝等，其中brahma相關(guān)基因1（Brg1）在子孢子感染后表達(dá)量增高（感染組/未感染組比值1.30）。Brg1是依賴ATP的染色質(zhì)改變復(fù)合物的核心催化亞基[27]，可以募集其他亞基并組成相應(yīng)的重塑復(fù)合物、識(shí)別目的基因序列進(jìn)而發(fā)揮染色質(zhì)重塑[28]，從而達(dá)到調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能。據(jù)報(bào)道，Brg1可以通過參與調(diào)控RUNX2的表達(dá)，調(diào)控成骨分化過程的進(jìn)行[29]，也參與了細(xì)胞衰老、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化等多種生物學(xué)過程。Brg1的上調(diào)可能是由于蟲體入侵后，引起宿主發(fā)生了一系列基因的表達(dá)的變化而引起的。

頂復(fù)門原蟲如隱孢子蟲[30]、泰勒蟲[31]、弓形蟲[32]、艾美球蟲[33]均能夠介導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡從而調(diào)控寄生蟲在宿主內(nèi)的發(fā)育。有研究表明，柔嫩艾美耳球蟲可誘導(dǎo)NF-kappa B激活，以保護(hù)宿主細(xì)胞不受凋亡的影響使其有良好的發(fā)育環(huán)境，在裂殖體成熟后，引起NF-kappa B抑制，觸發(fā)宿主細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)裂殖子的逸出[32]。我們發(fā)現(xiàn)在子孢子感染后，Caspase-3的下調(diào)表達(dá)（感染組/未感染組比值0.66），可能是蟲體通過抑制其表達(dá)，從而抑制宿主細(xì)胞的凋亡，以促進(jìn)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和發(fā)育。

本研究采用了iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)來分析E. tenella感染和未感染的CEF細(xì)胞之間的差異蛋白質(zhì)表達(dá)變化，共鑒定到259個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白145個(gè)，下調(diào)蛋白114個(gè)，這些差異表達(dá)蛋白主要參與了細(xì)胞外基質(zhì)受體互作、糖酵解/糖異生、粘著斑、氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等生物學(xué)功能，具有結(jié)合活性、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)子活性等分子功能。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為探索寄生蟲與宿主相互作用的機(jī)制提供了一個(gè)新的視角。