莊新建，徐紅梅，甘海峰，賀振，劉芳，張坤

(揚州大學 園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225000)

我國是世界上種植水稻歷史最悠久的國家，在我國糧食生產(chǎn)中，水稻播種面積占整個糧食作物播種面積的25%～30%，總產(chǎn)量則占全國糧食總產(chǎn)量的40%～45%，不論是單產(chǎn)還是總產(chǎn)都占糧食生產(chǎn)的第一位[1]；同時，我國有三分之二的人口以稻米為主食，因此，水稻生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位[1]。但水稻的生長發(fā)育經(jīng)常受到各種生物與非生物因素的脅迫，其中包括病毒危害[2]。水稻病毒病被稱為“水稻癌癥”，是當今國內(nèi)外難以攻克的“絕癥”，是水稻的重要病害，嚴重影響水稻生產(chǎn)[3]。例如，1992年3種水稻病毒病對世界水稻危害所造成的經(jīng)濟損失就達16.49億美元[4]。

目前，我國已發(fā)現(xiàn)10多種水稻病毒病，主要包括水稻矮縮病毒、水稻瘤矮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、水稻黑條矮縮病毒、水稻條紋葉枯病毒、水稻白葉病毒、水稻草狀矮化病毒、水稻黃矮病毒、水稻東格魯桿狀病毒、水稻東格魯球狀病毒、水稻黃斑駁病毒、水稻壞死花葉病毒、水稻條紋花葉病毒、水稻病毒A、水稻齒葉病毒。我國水稻病毒病種類很多，且發(fā)生時段和地域有重疊，給水稻病毒病的檢測與防治帶來了困難?，F(xiàn)有的水稻病毒檢測方法雖然有很多，但是能快速而準確地于田間根據(jù)癥狀判斷病原與檢測的方法卻十分混亂，本文旨在給水稻病害的檢測方法提供更多選擇，從而便于田間工作者快速準確地檢測出水稻病毒的類別，給水稻病毒病害的預測和防治奠定良好的基礎。

1 水稻病毒的分類

1.1 水稻矮縮病毒

水稻矮縮病毒(Ricedwarfvirus, RDV)是呼腸孤病毒科(Reovirudae)呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員。在自然條件下，RDV可以通過黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)或電光葉蟬(Reciliadorsalis)進行傳播，并可通過蟲卵傳給下一代[5]。該病毒廣泛分布于中國福建、云南的水稻種植區(qū)，造成水稻的嚴重減產(chǎn)[6]。水稻在苗期至分蘗期感染RDV后，病株出現(xiàn)矮縮、分蘗增多、葉片濃綠、僵直的癥狀(圖1中A)，生長后期病株不能抽穗結實[7]。RDV是一種直徑約70 nm的二十面體雙殼粒子(圖2中A)，其基因組由12個雙鏈RNA片段組成(S1～S12)。RDV基因組編碼7個結構蛋白(P1、P2、P3、P5、P7、P8和P9)和5個非結構蛋白(Pns4、Pns6、Pns10、Pns11和Pns12)。RDV衣殼的外殼由2種蛋白(P2和P8) 組成，內(nèi)芯由另外5種結構蛋白(P1、P3、P5、P7和P9)組成[8]。

1.2 水稻瘤矮病毒

水稻瘤矮病毒(Ricegalldwarfvirus, RGDV)于1980年首次在泰國中部發(fā)現(xiàn)，隨后在中國的廣東、廣西、福建也有發(fā)現(xiàn)[9]。RGDV主要由電光葉蟬 (Reciladorsalis)和黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)以持久性方式傳播，僅感染禾本科植物，病株嚴重矮縮(圖1中B①)，在葉背和葉鞘上長出淡黃綠色近圓形小瘤(圖1中B②)，可引起水稻嚴重減產(chǎn)[10]。RGDV屬于呼腸孤病毒科 (Reoviridae)呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)。病毒粒體為球形二十面體，有雙層衣殼，直徑約為65～70 nm(圖2中B)。其基因組包含12條雙鏈RNA片段，按照在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率從小到大的順序，分別命名為S1～S12[11]。

1.3 南方水稻黑條矮縮病毒

南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus, SRBSDV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae) 斐濟病毒屬 (Fijivirus)，SRBSDV病毒粒體呈球狀(圖2中C)，具有雙層外殼，直徑約為70～75 nm[12]。近年來我國江西、湖南、廣東、海南等省水稻矮縮病發(fā)生嚴重，據(jù)不完全統(tǒng)計，受害面積超過3×105hm2，約6 500 hm2水稻失收[13]。白背飛虱以持久性方式傳播SRBSDV，病毒可在蟲體內(nèi)復制增殖，蟲體一旦獲毒，即終生帶毒[14]。發(fā)病水稻出現(xiàn)葉色濃綠(圖1中C①)、明顯矮縮(圖1中C②)、分蘗增多(圖1中C③)的癥狀；病株莖稈上有乳白色或黑褐色瘤狀突起(圖1中C④)，高位分枝并在節(jié)間產(chǎn)生倒生須根；病株根系不發(fā)達，須根少而短[15]。SRBSDV的基因組由10條線性雙鏈RNA組成，總長度為29 121 bp，根據(jù)它們在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率由慢到快依次命名為S1到S10[16]。

1.4 水稻黑條矮縮病毒

水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus, RBSDV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)，主要經(jīng)灰飛虱(LaodelphaxstriatellusFallen)以持久性方式傳播[17]。完整的RBSDV病毒粒子為二十面體結構，外觀呈球形(圖2中D)，直徑約75 nm，由雙層衣殼組成，內(nèi)外層衣殼上各存在12個突起，衣殼內(nèi)部含有10條雙鏈RNA基因組片段，按其在凝膠上的電泳遷移率由慢至快依次稱為S1～S10[18]。感染RBSDV的水稻植株為濃綠矮縮，葉片僵直，不抽穗或穗小，葉背的葉脈和莖稈上有短條瘤狀突起(圖1中D)，該突起在發(fā)病初期呈蠟白色，后變?yōu)楹诤稚?，發(fā)病重的田塊甚至會絕產(chǎn)絕收[19]。近年來，RBSDV在江蘇、浙江、山東等地都有發(fā)生，且呈明顯的上升趨勢。RBSDV還可引起玉米粗縮病、小麥綠矮病，也能侵染多種禾本科雜草[20]。

1.5 水稻條紋葉枯病毒

水稻條紋葉枯病毒(Ricestipevirus, RSV)是纖細病毒屬(Tenuivirus)的典型成員，通過灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)以持久循回增殖的方式傳播，且RSV可以通過昆蟲經(jīng)卵傳遞給下一代[21]。感染RSV的水稻病株經(jīng)常出現(xiàn)褪綠的條紋斑點或斑塊(圖1中E)，一般最早出現(xiàn)在嫩葉，根據(jù)病株表現(xiàn)癥狀可以分為卷葉型和展葉型2類[22]。水稻條紋葉枯病主要分布于中國16個省市，給中國水稻生產(chǎn)造成嚴重損失[23]。RSV是單鏈RNA病毒，其基因組含有4條RNA鏈，分別為RNA1、RNA2、RNA3和RNA4，其病毒基因組鏈(vRNA) 和vcRNA各編碼1個蛋白，分別稱之為NS2 (p2)、NSvc2 (糖蛋白)、NS3 (p3)、NSvc3 (核衣殼蛋白)、NS4 (病害特異性蛋白)和NSvc4 (運動蛋白)[24]。RSV在形態(tài)上呈現(xiàn)出多型性，主要是表現(xiàn)為寬8～10 nm、長80～250 nm的分枝絲狀體(圖2中E)，有些表現(xiàn)為直徑3～8 nm的開環(huán)環(huán)狀體，但其中8 nm寬的粒子一般認為是由直徑3 nm長度不等的絲狀體纏繞而成[25]。

1.6 水稻白葉病毒

水稻白葉病毒(Ricehojablancavirus, RHBV)是纖細病毒屬(Tenuivirus)的成員，RHBV基因組包含4條單鏈RNA和3條雙鏈RNA，RHBV的RNA介導2種主要蛋白的合成，RNA3介導23 ku的NS3蛋白合成，RNA4介導21 ku NS4蛋白合成。RHBV的病毒粒子呈細絲狀，3～8 nm寬(圖2中F)，并且長度是可變的[26]。RHBV由稻飛虱(Tagosodesorizicolus)傳播，在水稻中引起白葉病，給熱帶和亞熱帶美洲主要水稻生產(chǎn)國造成了嚴重的損失[27]。感染RHBV的病株癥狀通常包括葉片上的綠化條紋(圖1中F)、植株矮化和穗部不育，造成水稻產(chǎn)量大幅下降。

1.7 水稻草狀矮化病毒

水稻草狀矮化病毒(Ricegrassystuntvirus, RGSV)于1963年在菲律賓首次被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)褐飛虱(Nilaparvatalugens)以持久性方式傳播。RGSV也是纖細病毒屬(Tenuivims)的成員，病毒粒體由核衣殼蛋白和基因組RNA組成。病毒粒子為直徑4～8 nm的線狀或長分枝形絲狀粒體(大部分長950～1 350 nm) (圖2中G)，并能形成環(huán)狀結構[28]。RGSV于20世紀70年代曾在南亞、東南亞大面積發(fā)生，之后在我國的福建、臺灣、廣東、廣西和海南等地也有發(fā)生[29]。RGSV基因組由6條單鏈RNA組成，其6個片段均釆用雙義編碼策略[30]。植株感染后，一般呈現(xiàn)明顯矮化、分蘗增多、葉片褪綠條紋明顯，葉片細小、葉窄而剛、淡綠到淡黃或橙黃色，有時在葉片上會形成大量形狀不規(guī)則的暗褐色或銹色小斑(圖1中G)，感病植株基本不抽穗[28]。

A—水稻矮縮病毒侵染水稻出現(xiàn)矮縮、分蘗增多癥狀；B—水稻瘤矮病毒侵染水稻出現(xiàn)嚴重矮縮①、葉背上圓形或近圓形瘤狀突起的癥狀②；C—南方水稻黑條矮縮病毒侵染水稻出現(xiàn)葉色深綠①、矮縮叢生②、高位分蘗③、倒生須根、抽穗困難、旗葉寬短和葉面凹凸④等癥狀；D—水稻黑條矮縮病毒侵染水稻出現(xiàn)明顯矮縮、葉片僵直等癥狀；E—水稻條紋葉枯病毒侵染水稻出現(xiàn)明顯褪綠的條紋斑點或斑塊的癥狀；F—水稻白葉病毒侵染水稻出現(xiàn)綠化條紋的癥狀；G—水稻草狀矮化病毒侵染水稻出現(xiàn)明顯矮化、分蘗增多、葉片褪綠條紋明顯，葉片細小、葉窄而剛癥狀；H—水稻黃矮病毒侵染水稻出現(xiàn)黃化、分蘗減少，植株矮化，株形松散等癥狀；I—水稻東格魯球狀病毒侵染水稻出現(xiàn)葉片顏色為橙色至黃色等癥狀；J—水稻黃斑駁病毒侵染水稻出現(xiàn)黃斑、分蘗減少癥狀；K—水稻壞死花葉病毒侵染水稻出現(xiàn)矮化，分蘗增生，新葉皺縮、扭曲癥狀；L—水稻東格魯桿狀病毒侵染水稻出現(xiàn)黃葉、斑駁等癥狀；M—水稻條紋花葉病毒侵染水稻出現(xiàn)黃色條紋①、扭轉畸形②等癥狀；N—水稻齒葉病毒侵染水稻出現(xiàn)卷葉①、葉片深綠②、明脈腫③等癥狀。圖1 水稻病毒病的癥狀資料來源:文獻[12, 41-52]。

A—水稻矮縮病毒粒子直徑約70 nm的二十面體雙殼粒子；B—水稻瘤矮病毒粒子為球狀二十面體；C—南方水稻黑條矮縮病毒粒子呈球狀(CW為細胞壁)；D—水稻黑條矮縮病毒粒子為二十面體結構，外觀呈球形；E—水稻條紋葉枯病毒粒子為分枝絲狀體；F—水稻白葉病毒粒子呈細絲狀；G—水稻草狀矮化病毒粒子為線狀或長分枝絲狀粒體；H—水稻黃矮病毒粒子為彈狀；I—水稻東格魯球狀病毒粒子具有直徑30 nm的等徑球體；J—水稻黃斑駁病毒粒子是等距的、直徑約26 nm；K—水稻壞死花葉病毒粒子為絲狀；L—水稻東格魯桿狀病毒粒子為桿狀；M—水稻條紋花葉病毒粒子為桿狀體(箭頭表示囊泡結構中聚集了病毒粒子，字母M為線粒體)；N—水稻齒葉病毒粒子呈二十面體結構。圖2 水稻病毒粒子的透射電鏡資料來源:文獻[7, 41, 51, 60-69]。

1.8 水稻黃矮病毒

水稻黃矮病毒(Riceyellowshuntvirus, RYSV)是彈狀病毒科(Rhabdoviridae)細胞核彈狀病毒屬 (Nudeorhabdovirus)的成員，其基因組由1條長負義單鏈RNA組成[31]，RNA的長度約為12 kb[32]。病毒彈狀粒子長度為120～136 nm、寬度為88～100 nm (圖2中H)，具有(83～100) nm×(40～50) nm大小的核心，外壁厚度約25 nm[33]。目前發(fā)現(xiàn)，該病毒的寄主是水稻，RYSV主要由黑尾葉蟬 (Nephotettixcincticeps)以持久性方式傳播，病稻汁液和種子不能傳播病毒[32]。RYSV于1964年最早在中國廣東發(fā)現(xiàn)，之后在中國南方各個省份廣泛流行[32]。水稻黃矮病主要特征是矮化、花葉、黃枯，在水稻分蘗期發(fā)生。病株少分蘗、矮化，株形松散(圖1中H)，根系短小衰朽，輕病株抽穗推遲，谷穗短小。谷穗不能抽出或抽出半包穗，谷粒發(fā)育不良，秕谷多，若防治不及時，一般會使水稻減產(chǎn)20%～80%[33]。

1.9 水稻東格魯球狀病毒

水稻東格魯球型病毒(Ricetungrosphericalvirus，RTSV)屬于伴生病毒科(Sequiviridae)矮化病毒屬(Waikavirus)[34]。RTSV病毒粒子具有直徑30 nm的等徑球體(圖2中I)[35]，內(nèi)部包含多聚腺苷酸單鏈RNA，其基因組由大約12 kb的單鏈RNA組成，它編碼一個393 ku的大型多聚蛋白和3′端2個開放閱讀框。只感染RTSV癥狀較輕，如輕度發(fā)育遲緩(圖1中I)，但是同時感染RTBV和RTSV的植物病狀會加重[36]。RTSV主要由二點黑尾葉蟬 (Nephotettixvirescens)、黑尾葉蟬(N.cincticeps)、二條黑尾葉蟬 (N.nigropictus)等以半持久性方式傳播的[35]。

1.10 水稻黃斑駁病毒

水稻黃斑駁病毒(Riceyellowmottlevirus，RYMV)是南方菜豆花葉病毒屬(Sobemovirus)的成員[37]。這種病毒能通過機械和蛹蟲傳播，在非洲引起嚴重疾病。病毒感染時，最幼嫰葉片底部出現(xiàn)黃色或變色的點，這些點以平行于葉脈的方式擴張；受感染的葉片會變成黃色或橙色，導致分蘗減少，植株發(fā)育不良[38](圖1中J)。RYMV病毒粒子是等距的、直徑約26 nm的球形結構(圖2中J)。RYMV基因組由4 450 nt長的單鏈RNA組成，包含4個開放閱讀框(ORFs)。ORF1編碼未知功能蛋白P1 (17.8 ku)。ORF2編碼110 ku的多聚蛋白。ORF3嵌套在ORF2不同的閱讀框中，編碼功能未知的蛋白p3 (13.7 ku)。ORF4編碼26 ku的外殼蛋白(CP)[39]。

1.11 水稻壞死花葉病毒

水稻條紋壞死病毒(Ricenecrosismosaicvirus, RNMV)是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae) 大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)的成員。RNMV首先在日本被發(fā)現(xiàn)，隨后在印度的水稻種植區(qū)中也發(fā)現(xiàn)此病毒。該病毒侵染能引起水稻植株花葉癥狀，表現(xiàn)為下葉上的黃色斑點和條紋癥狀(圖1中K)[40]。馬鈴薯Y病毒科中大麥黃花葉病毒屬由2條正義單鏈RNA基因組組成，包括7.3～7.6 kb RNA1和3.5～3.7 kb RNA2。RNMV病毒粒子呈彎曲的桿狀結構(圖2中K)，其RNA被外殼蛋白(CP)包裹，形成直徑13 mm、長度分別為550 nm和275 nm的絲狀病毒粒子。感染RNMV的水稻病株矮化，分蘗增生，新葉皺縮、扭曲，葉片上有黃色條紋，后期沿葉緣出現(xiàn)條紋壞死。RNMV傳播介體為多粘霉菌(Polymvxagraminis)，自然寄主僅限于水稻[40-52]。

1.12 水稻東格魯桿狀病毒

東格魯病由2種形態(tài)和基因組不同的病毒引起，水稻東格魯桿狀病毒(Ricetungrobacilliformvirus, RTBV)是花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)桿狀DNA病毒屬(Badnavirus)[34]的成員。病毒粒子為桿狀(圖2中L)，粒子長度150～350 nm，由環(huán)狀雙鏈DNA和單一蛋白組成，RTBV是雙鏈DNA病毒，通過RNA進行復制，其基因組包含3個雙鏈DNA，其中2個為8 002 bp,一個為8 000 bp[33]。RTBV的DNA雙鏈上各有1個不連續(xù)區(qū)域[53]。感染RTBV后的水稻植株會出現(xiàn)黃橙色的葉狀變色和發(fā)育不良(圖1中L)的癥狀[34]。RTBV主要由二點黑尾葉蟬(Nephotettixvirescens)、黑尾葉蟬(N.cincticeps)、二條黑尾葉蟬(N.nigropictus)、馬來亞黑尾葉蟬(N.malayanus)、細小黑尾葉蟬(N.parvus)和電光葉蟬(Reciliadorsalis)以半持久性方式傳播[35]。

1.13 水稻條紋花葉病毒

水稻條紋花葉病毒(Ricestripemosaicvirus, RSMV)于2015年首次在中國廣東省的稻田中被發(fā)現(xiàn)，RSMV是彈狀病毒科(Rhabdoviridea)細胞質彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)的新成員[54]。RSMV由電光葉蟬(Reciliadorsalis)以持久增殖型方式傳播。由RSMV引起的稻條紋花葉病常表現(xiàn)為植株輕度矮化，葉片呈黃色條帶或鑲嵌(圖1中M①)，葉尖扭曲，重病株葉片基部扭轉畸形(圖1中M②)，抽穗不完全，籽粒不飽滿[54]。RSMV病毒粒子為桿狀，長度為300～375 nm，寬度為45～55 nm (圖2中M)。其基因組為負義單鏈RNA，能編碼2個非結構蛋白和5個結構蛋白[55]。

1.14 水稻病毒A

水稻病毒A (RicevirusA, RVA)首先在韓國被發(fā)現(xiàn)和報道，是番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)的成員，RVA基因組為4 832 nt[56]。RVA基因組存在5個開放閱讀框(ORFs)，ORF1編碼32 ku的蛋白(p32)，ORF2編碼90 ku的蛋白，ORF3編碼49 ku的外殼蛋白(CP)，ORF4編碼1個24 ku的運動蛋白(MP)，ORF5編碼19 ku的蛋白，很可能是一個沉默抑制子[56]。

1.15 水稻齒葉病毒

水稻齒葉病毒(Riceraggedstuntvirus, RRSV)于1976年首先在印度尼西亞和菲律賓發(fā)現(xiàn)，1978年以來先后在我國的福建、廣東、臺灣、江西、湖南和浙江等省發(fā)現(xiàn)[57]。RRSV經(jīng)褐飛虱(Nilaparvatalugens)持久性傳播，病株表現(xiàn)葉片扭曲、呈鋸齒狀缺刻(圖1中N①)，濃綠矮縮(圖1中N②)，在葉背和葉鞘生有細長脈腫(圖1中N③)，分蘗期前發(fā)病能抽穗；后期發(fā)病則抽穗不完全、谷粒不充實等癥狀[58]。RRSV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)稻病毒屬(Oryzavirus)的成員。RRSV的病毒顆粒具有雙層外殼，呈二十面體結構，帶有約寬20 nm、高10 nm的扁平突起，整病毒粒體直徑約為70 nm (圖2中N①)，核心顆粒直徑約50 nm (圖2中N②)。RRSV基因組包含10條雙鏈RNA[59]。

2 水稻病毒的檢測

目前，檢測水稻病毒的方法有很多種，病毒的檢測方法正朝著快速、靈敏、簡便、準確的方向不斷發(fā)展和改進。常用的植物病毒檢測方法有生物學方法、免疫學方法、電子顯微鏡檢測方法和分子生物學方法等[15]。本文主要對水稻病毒的分子檢測方法和免疫學檢測方法進行綜述。

2.1 分子檢測方法

水稻病毒的遺傳物質通常是DNA或RNA，因此，可以從分子水平上去檢測病毒是否存在，只要能檢測到病毒核酸的存在，就證明了分子檢測的有效性。隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子生物學方法已經(jīng)成為水稻病毒檢測的重要方法，主要包括核酸雜交技術(Technique of nucleic acid hybridization)、聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)等。分子檢測用到的主要引物見表1。

表1 水稻病毒分子檢測使用的引物

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.2 免疫學檢測方法

免疫學方法在水稻病毒檢測中是一種常用、有效的方法。水稻病毒的主要成分是蛋白質和核酸結合而成的核蛋白，核蛋白是很好的抗原，特異性的抗體與相應的抗原結合會使抗原失去活力，這種過程稱為免疫反應。目前水稻病毒檢測中應用較為廣泛的免疫學檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、斑點雜交印跡(dot-blot immunoassay, DIBA)、蛋白質印跡法(Western blot)等(表2)。

表2 免疫學方法檢測的水稻病毒

表2(續(xù))

3 小結

隨著分子生物學的逐漸進步，分子檢測技術廣泛應用于水稻病毒的檢測，該技術可有效檢測昆蟲介體和水稻的病毒。與免疫法相比，分子檢測技術具有快速、靈敏和特異性強的優(yōu)點，且不需要制備抗血清。但是在實用性和使用成本方面，RT-PCR方法所使用的儀器和試劑成本比較高，需要專業(yè)人員進行實驗操作，并且不適于大量的樣品檢測。所以很難在基層植保工作中得以推廣，目前只適合在實驗室中對水稻病毒鑒定的結果進行必要的驗證和補充。在免疫檢測技術方面，目前應用較廣泛的是利用間接ELISA法和DIBA法來檢測介體昆蟲帶毒狀況和田間水稻狀況，進而對水稻病毒病害發(fā)生情況進行預測預報。這2種方法不僅擁有較高的準確性，還簡化了操作程序，檢測結果易于觀察，使檢測更加快速簡便，同時適合大量樣品檢測。所以間接ELISA法和DIBA法檢測水稻病毒病害適合在基層植保工作中普及。