劉玉紅，孫彩霞*，宗侃侃，趙學(xué)平，張岑容

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 2.磐安縣中藥材研究所，浙江 磐安 322300)

浙貝母(Fritillariathunbergii)是百合科貝母屬多年生草本植物，其成熟期干燥鱗莖供入藥所用，具有清熱化痰、散結(jié)消癰的效用，歷版《中國(guó)藥典》均有收載[1-3]。浙江省是我國(guó)浙貝母主要種植區(qū)，種植面積和產(chǎn)量占全國(guó)90%左右，種植面積約0.333萬hm2，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶致富的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)[4]。磐安縣作為浙江省浙貝母的主產(chǎn)區(qū)，其浙貝母產(chǎn)量占全國(guó)的60%以上。近年由于浙貝母無性繁殖、連作障礙和土壤微肥力難以把控等問題，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降、品質(zhì)參差不齊，尤其是老產(chǎn)區(qū)品質(zhì)退化現(xiàn)象更為突出，嚴(yán)重影響了外界對(duì)于浙貝母療效的評(píng)價(jià)[5-6]。傳統(tǒng)的浙貝母成品質(zhì)量評(píng)價(jià)主要以外觀為依據(jù)，以鱗葉肥厚、質(zhì)硬而脆、富粉性、斷面色白者為佳，近年則多以浙貝母有效成分含量高低作為品質(zhì)評(píng)價(jià)的內(nèi)在指標(biāo)[7]。浙貝母的藥用有效成分是生物堿，其中貝母素甲和貝母素乙含量較高，且具有止咳平喘、鎮(zhèn)痛抗炎和清熱潤(rùn)肺等多種藥理作用，成為評(píng)價(jià)其有效成分的主要指標(biāo)[8-10]?！吨袊?guó)藥典》評(píng)價(jià)浙貝母質(zhì)量主要是通過測(cè)定貝母素甲和貝母素乙的總含量。HPLC-ELSD(蒸發(fā)光散射檢測(cè)器)分析是檢測(cè)貝母有效成分的一種有效方法，已用于多種貝母屬植物的檢測(cè)[11-13]，但鮮見在浙貝母上的報(bào)道。通過運(yùn)用此法對(duì)磐安縣抽檢的浙貝母的干樣和鮮樣的貝母素甲和貝母素乙含量進(jìn)行檢測(cè)，以期引起相關(guān)部門對(duì)浙貝母品質(zhì)把控的重視。

1 材料與方法

1.1 供試材料

浙貝母藥材購自浙江磐安種植戶，經(jīng)浙江省中藥研究所鑒定為浙貝母的鱗莖。貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品購自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)分別為110750～201612、110751～201110)。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100系列高效液相色譜儀及Agilent化學(xué)工作站(美國(guó)Agilent公司)；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Alltech公司)。

乙腈(色譜純，韓國(guó)Honeywell公司)；二乙胺(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；三氯甲烷(分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司)；水為超純水，經(jīng)杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司UPWS-Ⅰ-10(二級(jí))超純水器過濾。

1.3 前處理方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為美國(guó)ES CaprisilC18-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%二乙胺溶液(65∶35)，流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃；ELSD參數(shù)為漂移管溫度90 ℃，氮?dú)饬魉贋?.5 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。理論板數(shù)按貝母素甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品適量，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至適當(dāng)濃度，搖勻，制成每1 mL含0.240 mg貝母素甲和0.186 mg貝母素乙的溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置燒瓶中，加濃氨試液4 mL浸潤(rùn)1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇(4∶1)的混合液40 mL，稱定重量，混勻，置80 ℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合液補(bǔ)足減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芤喝芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，即得。

1.4 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液5、10、15 μL，供試品溶液5～15 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算貝母素甲、貝母素乙的含量，即得。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系

精密吸取對(duì)照品溶液3、6、9、12、15 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程，貝母素甲回歸方程為Y=2 313.083X-1 211.220，r=0.994 7；貝母素乙回歸方程為Y=2 001.971X-842.860，r=0.995 2。結(jié)果表明，貝母素甲在0.720～3.600 μg呈良好的線性關(guān)系，貝母素乙在0.558～2.790 μg呈良好的線性關(guān)系。

1.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5 μL。結(jié)果顯示，貝母素甲平均峰面積為2 322.8，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.78%(n=6)；貝母素乙平均峰面積為1 499.4，RSD為2.93%(n=6)。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，依上述色譜條件，分別在0、4、6、8 h進(jìn)樣5 μL測(cè)定。結(jié)果顯示，貝母素甲平均峰面積為2 243.2，RSD為4.29%(n=4)；貝母素乙平均峰面積為1 492.7，RSD為4.38%(n=4)。表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批號(hào)的浙貝母粉末樣品7份，按供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件各進(jìn)樣5 μL測(cè)定，依上述條件測(cè)定貝母素甲和貝母素乙含量，結(jié)果浙貝母藥材中，貝母素甲平均含量為0.111 4%，RSD為1.79%(n=7)；貝母素乙平均含量為0.072 3%，RSD為2.58%(n=7)。

1.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

取6份已知含量的供試品約1 g，精密稱定，分別添加貝母素甲對(duì)照品溶液(0.412 mg·mL-1)和貝母素乙對(duì)照品溶液(濃度為0.372 mg·mL-1)各2 mL，按擬定的方法制成供試品溶液，依供試品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5.6 水分檢測(cè)

依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0832第二法烘干法。取浙貝母藥材約2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，打開瓶蓋在105 ℃烘5 h，根據(jù)減失的重量，計(jì)算浙貝母藥材中含水量。按上述條件測(cè)定浙貝母干樣和鮮樣中貝母素甲和貝母素乙的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析

由圖1可知，在此色譜條件下，貝母素甲和貝母素乙與其他成分能較好地分離。

圖1 對(duì)照品和樣品溶液的HPLC譜圖

2.2 加樣回收率試驗(yàn)

表1表明，貝母素甲平均回收率為99.03%，RSD為2.96%(n=6)；貝母素乙平均回收率為95.47%，RSD為2.43%(n=6)。

表1 浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的回收率

2.3 貝母素甲和貝母素乙含量

根據(jù)《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，貝母素甲和貝母素乙總量不得少于0.080%，水分不得超過18%。在磐安縣調(diào)研的10個(gè)鮮樣和10個(gè)干樣測(cè)定結(jié)果(表2)表明，鮮樣的貝母素甲和貝母素乙的總含量均超過0.080%，達(dá)到《中國(guó)藥典》要求。但抽檢的農(nóng)戶自行干燥的10個(gè)浙貝母干樣里，有5個(gè)樣品的貝母素甲和貝母素乙的總含量未達(dá)標(biāo)，有些甚至只有《中國(guó)藥典》所要求的一半。

表2 浙貝母干樣和鮮樣中貝母素甲和貝母素乙的含量

3 討論與小結(jié)

研究表明，有效成分已成為道地藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[14]。中藥材的加工干燥是其藥性形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15-18]，因此，加工方式對(duì)浙貝母的有效成分有直接影響。據(jù)文獻(xiàn)記載[19]，浙貝母生品的加工主要有5種:貝殼粉吸法、生切脫水法、冷凍干燥法、微波干燥法和硫黃熏蒸法。其中，貝殼粉吸法需擦去表皮，會(huì)損失較多的表皮生物堿，且此法需要攤曬多日，易受氣候因素的制約，產(chǎn)能效率低，已不再適用；生切片法不會(huì)造成表皮生物堿損失，但切片較薄，質(zhì)地較脆，不利于運(yùn)輸，且加工能耗大。近年來冷凍和微波加工技術(shù)興起，逐漸引起人們的關(guān)注[20]。雖然干燥樣品的品質(zhì)與形態(tài)俱佳，但設(shè)備昂貴，不適用于大批量浙貝母起土?xí)r加工。劉青梅等[21]利用熱風(fēng)-微波聯(lián)合干燥技術(shù)，優(yōu)化浙貝母加工工藝，即通過縮短熱風(fēng)干燥時(shí)間，降低能耗，同時(shí)解決了由于微波干燥失水速率過快而導(dǎo)致的浙貝母品質(zhì)較差等問題，由于此法對(duì)設(shè)備要求高，目前尚未普及使用。硫黃熏制法是延長(zhǎng)中藥材保存時(shí)間的一種傳統(tǒng)加工方法，具有外觀增色，以及防腐、防蛀等優(yōu)勢(shì)，但硫黃熏制后，會(huì)導(dǎo)致浙貝母中的有效成分發(fā)生變化，而殘留的硫黃成分對(duì)人體不利，此法已經(jīng)逐漸被淘汰[22-23]。因此，還需進(jìn)一步完善發(fā)展浙貝母的加工技藝。

通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前磐安縣主要通過切片烘干方式對(duì)浙貝母進(jìn)行加工。根據(jù)《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，貝母素甲和貝母素乙總量不得少于0.080%，水分不得超過18%。在磐安縣調(diào)研的10個(gè)鮮樣測(cè)定結(jié)果表明，貝母素甲和貝母素乙的總含量均超過0.080%，達(dá)到《中國(guó)藥典》要求。但抽檢的農(nóng)戶自行干燥的10個(gè)浙貝母干樣里，有5個(gè)樣品的貝母素甲和貝母素乙的總含量未達(dá)標(biāo)，有些甚至只有《中國(guó)藥典》所要求的一半。通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，部分農(nóng)戶會(huì)選擇80 ℃左右的高溫干燥浙貝母，以此縮短干燥時(shí)間，提高經(jīng)濟(jì)效益。由此推斷，干燥溫度可能是影響貝母素含量的一大因素。陳雪濤等[24]研究了不同溫度干燥浙貝母，然后測(cè)定其貝母素甲和貝母素乙的含量，結(jié)果顯示，60 ℃熱風(fēng)干燥浙貝母中活性成分含量最高，80 ℃干燥雖然用時(shí)短，但活性成分較低，因此，60 ℃熱風(fēng)干燥是浙貝母的最佳干燥溫度，這與本試驗(yàn)一致。金玉琴等[25]研究表明，由于浙貝母生物堿不耐高溫的因素，建議采用低溫干燥技術(shù)加工浙貝母。值得注意的是，在達(dá)到《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的鮮樣里，部分樣品的貝母素甲和貝母素乙的總含量仍然偏低，這將影響外界對(duì)磐安縣浙貝母品質(zhì)的評(píng)價(jià)。

產(chǎn)地環(huán)境等條件是道地藥材品質(zhì)的重要外在因素，會(huì)直接影響到道地藥材的生長(zhǎng)發(fā)育及其有效成分的形成和積累[26]。宋林強(qiáng)[27]研究表明，不同施鉀量下浙貝母生物量、產(chǎn)量存在顯著差異，這說明土壤肥力對(duì)浙貝母的有效成分有著明顯的影響。近年來，雞糞作為農(nóng)家肥的替代品，作為浙貝母的肥料廣泛應(yīng)用。盧曉等[28]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以有機(jī)雞糞作基肥有利于提高浙貝母的產(chǎn)量，但高肥不利于有效成分的積累，菇渣覆蓋有助于提升貝母素甲和貝母素乙的含量。綜合考慮產(chǎn)量和質(zhì)量，提出把有機(jī)雞糞+菇渣的組合推薦作為生產(chǎn)上的施肥措施。

磐安縣浙貝母質(zhì)地優(yōu)良，粉性足，深受國(guó)內(nèi)外客商的歡迎。浙貝母的品質(zhì)下降將影響磐安縣浙貝母產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展，應(yīng)引起高度重視，而樹立磐安縣作為“中國(guó)藥材之鄉(xiāng)”的新形象，提高道地藥材質(zhì)量就顯得尤為重要。貝母素甲和貝母素乙是浙貝母藥材中的主要活性生物堿，其含量易受干燥溫度和產(chǎn)地環(huán)境的影響。為了提高磐安縣浙貝母的品質(zhì)，建議盡量避免散戶單獨(dú)干燥處理，選擇合適的烘干溫度進(jìn)行集中加工、規(guī)范化管理，同時(shí)采用合理的施肥措施，確保浙貝母有效成分的形成和積累。