鄧 莉，田 靜

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 脾胃科，湖北 恩施 445000)

結(jié)腸癌(Colon cancer)發(fā)病率位居第3位，也是導致癌癥死亡的主要原因之一。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蔬菜、水果和豆類的攝入量與腫瘤發(fā)病率和死亡率呈負相關(guān)；如多吃葡萄、花生和漿果會大大降低癌癥發(fā)生的風險，包括結(jié)腸癌和前列腺癌[1]。白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種植物抗毒素，存在于多種植物中，對腫瘤細胞具有較好的化療作用[2]。目前雖已有一些關(guān)于RES對結(jié)腸癌細胞影響的研究，包括RES對人結(jié)腸癌細胞有明顯的抑制作用[3]，RES通過調(diào)節(jié)線粒體/內(nèi)源性和受體/外源性凋亡途徑以及非依賴性caspase途徑的多個靶點介導凋亡[4]等，但對正常細胞影響的研究很少，故有必要了解RES在抗癌細胞的同時對病灶周圍正常細胞的毒性作用。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的超家族，可將各種胞外信號傳遞至細胞核而發(fā)揮重要作用[5]。眾所周知，MAPKs構(gòu)成一個大的分子信號網(wǎng)絡，調(diào)節(jié)各種生理過程，如細胞生長、分化、細胞周期和細胞凋亡[6-7]。最近的數(shù)據(jù)表明，骨髓細胞瘤病毒癌基因(c-Myc)也是調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞周期機制的核心和關(guān)鍵[8-9]。鑒于MAPKs和c-Myc表達在細胞應對外界刺激中的關(guān)鍵作用，本文考察了RES對結(jié)腸上皮NCM460細胞和結(jié)腸癌HCT116細胞生長、凋亡、MAPK信號通路及c-Myc蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 白藜蘆醇購自Sigma公司，批號：501-36-0；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自英國Gibco公司；Erk1/2(批號ab2098361)、p-Erk1/2(批號ab1109632)、P38 MAPK(批號ab1090263)、p-P38 MAPK(批號ab1238790)、JNK1/2(批號ab1097864)、p-JNK1/2(批號ab1437890)和c-Myc(批號ab1243784)抗體購自英國Abcam公司；羊抗兔二抗購自上海谷歌生物有限公司；ECL顯影液購自北京百奧萊博科技有限公司(批號GL1055)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州碧云天生物公司(批號C1062S)。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理 人結(jié)腸上皮NCM460細胞系和結(jié)腸癌HCT116細胞系來源于武漢杰諾公司，采用DMEM完全培養(yǎng)液(含10%FBS、1%的100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素)孵育細胞，培養(yǎng)溫度37 ℃、CO2濃度為5%。將對數(shù)期細胞(1×106個/孔)接種于6孔板孵育24 h，然后采用RES(0、10、20、40 μM)處理細胞72 h，培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱。

1.3 細胞形態(tài)和克隆分析 細胞經(jīng)“1.2”項藥物處理后，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并拍照。并隨機選擇10個視野，計數(shù)細胞，計算平均作為細胞的克隆數(shù)。

1.4 細胞周期分布和凋亡率檢測 細胞經(jīng)“1.2”項藥物處理后，收集各組細胞，PBS清洗2次，收集細胞，采用2.0 mg/mL的PI染液和RNase I染色30 min，流式細胞儀立即檢測細胞周期分布情況。另外，收集細胞，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞(按照試劑盒操作說明書進行)，最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 蛋白相對表達水平分析 細胞經(jīng)“1.2”項處理后，PBS清洗細胞3次，收集各組細胞裂解、超聲破碎、12 000 r/min離心12 min后收集上清，BCA試劑盒測定上清蛋白濃度。每個樣本上樣50 μg進行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進行轉(zhuǎn)膜實驗。結(jié)束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h后，分別加入Erk1/2、p-Erk1/2、P38 MAPK、p-P38 MAPK、JNK1/2、p-JNK1/2和c-Myc抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)4 ℃反應過夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG(體積稀釋比例為1:3 000)，室溫反應1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計，兩兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RES對NCM460和HCT116細胞形態(tài)和生長的影響 NCM460和HCT116細胞經(jīng)RES處理后，兩種細胞均逐漸從培養(yǎng)皿底部收縮和分離，并且NCM460細胞形態(tài)明顯優(yōu)于HCT116細胞(見圖1A)。從細胞克隆數(shù)比較可見，RES處理可明顯減少NCM460和HCT116細胞克隆數(shù)，而HCT116細胞克隆數(shù)降低得更為顯著(P<0.05，見圖1B)。

與0 μM的RES組比較，*：P<0.05；A：細胞克隆圖；B：細胞克隆計數(shù)。圖1 RES對NCM460和HCT116細胞形態(tài)和生長的影響

2.2 RES對NCM460和HCT116細胞周期分布的影響 經(jīng)20、40 μM的RES處理72 h后，G1期分布的NCM460細胞相對于0 μM的RES組明顯降低，而G2期細胞分布則明顯增多(P<0.05)。經(jīng)10、20、40 μM的RES處理72 h后，G1期分布的HCT116細胞相對于0 μM的RES組明顯降低，而G2期細胞分布則明顯增多(P<0.05)。進一步比較發(fā)現(xiàn)，40 μM的RES處理后相比于0 μM的RES組NCM460細胞G1期細胞數(shù)降低11%、而G2期細胞數(shù)增多了0.91倍；20、40 μM的RES處理后相比于0 μM的RES組，HCT116細胞G1期細胞數(shù)分別降低20%和33%，而G2期細胞數(shù)分別增高了0.43倍和0.91倍。

與0 μM的RES組比較，*：P<0.05。圖2 RES對NCM460和HCT116細胞周期分布的影響

2.3 RES對NCM460和HCT116細胞凋亡的影響 經(jīng)10、20、40 μM的RES處理72 h后，HCT116細胞凋亡率相對于0 μM的RES組分別增高了3.1倍、7.9倍和13.1倍(P<0.05)。10、20 μM的RES處理72 h后，NCM460細胞凋亡率相對于0 μM的RES組沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05)，而40 μM的RES處理72 h后，NCM460細胞凋亡率增高了2.9倍(P<0.05)，見圖3。

與0 μM的RES組比較，*：P<0.05。圖3 RES對NCM460和HCT116細胞凋亡的影響

2.4 RES對NCM460和HCT116細胞中MAPK信號通路和c-Myc蛋白表達的影響 為了考察NCM460和HCT116細胞中增殖相關(guān)信號通路的作用，實驗分析了10、20、40 μM的RES處理細胞72 h后MAPK的磷酸化狀態(tài)和c-Myc表達。Western blot實驗結(jié)果顯示，RES處理后NCM460和HCT116細胞中Erk1/2、p-P38 MAPK、P38 MAPK和JNK1/2并沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05)。另外，NCM460細胞中p-Erk1/2蛋白表達水平隨著RES濃度升高而增多(P<0.05)，而在HCT116細胞中沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05)。在HCT116細胞中，p-JNK1/2表達水平隨RES濃度升高而增高，c-Myc表達水平則降低(P<0.05)；而p-JNK1/2和c-Myc蛋白表達水平在HCT116細胞中沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05，見表1、圖4)。

圖4 RES對NCM460和HCT116細胞中MAPK信號通路和c-Myc蛋白表達的影響

表1 各組間MAPK信號通路和c-Myc 表達水平的比較

3 討論

最近研究綜述RES可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯，降低癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，增強腫瘤細胞的化療/放療敏感性，除此對糖尿病也有改善作用。基于這些數(shù)據(jù)，RES被認為是治療腫瘤的一種潛在的抗癌劑[10]。已有較多報道指出，RES抑制腫瘤生長，也揭示其化療保護的分子機制[11]。然而，本研究首次比較RES對肺致癌性結(jié)腸上皮細胞和致癌性結(jié)腸癌細胞的影響。成年哺乳動物中，腸道和結(jié)腸上皮細胞是最容易自我更新的組織(3～5 d)。本研究發(fā)現(xiàn)，10～40 μM的RES處理細胞72 h可減少致瘤性HCT116結(jié)腸癌細胞G1期分布，并且對HCT116細胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于非致瘤性NCM460結(jié)腸上皮細胞。同樣，10～40 μM的RES對HCT116細胞有明顯的凋亡誘導作用，但對NCM460細胞無明顯作用。有趣的是發(fā)現(xiàn)RES抑制結(jié)腸癌細胞生長，而對非致瘤性結(jié)腸細胞影響較小。這一觀察結(jié)果與抗癌藥物通常能有效抑制腫瘤細胞生長而不是正常細胞生長的事實是一致的。

因為MAPK信號通路在細胞增殖、分化和存活中起著關(guān)鍵作用[12]，本實驗也發(fā)現(xiàn)，RES對NCM460和HCT116細胞中MAPK信號活性的影響也有差異。JNK1/2、P38 MAPK和Erk1/2是最重要的MAPK信號通路[13]。通常認為生長因子激活的Erk1/2是細胞存活的前期，而P38 MAPK和JNK1/2信號是細胞應激反映的結(jié)果，被認為是細胞凋亡的介質(zhì)[14]。本研究結(jié)果證實，RES處理可上調(diào)NCM460細胞中Erk1/2的磷酸化，而對HCT116細胞中沒有影響。另外，雖然P38 MAPK信號的磷酸化沒有發(fā)生變化，但是RES會增加HCT116細胞中JNK1/2磷酸化。

為了進一步理解上述分子機制，實驗檢測c-Myc蛋白表達，結(jié)果提示RES抑制HCT116細胞中c-Myc蛋白表達，對NCM460細胞沒有影響。由于c-Myc參與細胞增殖和凋亡過程，在腫瘤的形成和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[15-16]，而且已有研究表明，Erk1/2通路對細胞分裂通過G1期是必不可少的，而Erk1/2和c-Myc激活對于驅(qū)動細胞從G0期到G2期也是必須的[17]。我們的實驗結(jié)果顯示，RES處理也明顯誘導HCT116細胞凋亡和G1期細胞分布減少，但對NCM460細胞相關(guān)的作用效應明顯較弱。因此，非致瘤性結(jié)腸上皮細胞和致瘤性結(jié)腸癌細胞對RES的敏感性存在差異，至少部分解釋了RES抗癌作用的分子基礎(chǔ)。