胡瑤瑤，汪謝嬡，馮光勇，岳國軍，楊明鎮(zhèn)，張貴海

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義 563099；2.湘南學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤科，湖南 郴州 423000；3.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000；4.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，貴州 遵義 563000；5.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 介入科，貴州 遵義 563099)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道腫瘤之一，約25% CRC患者在確診時就已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[1]，另約25% CRC患者在疾病治療過程中發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]，是其治療失敗的主要原因之一，而腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。電壓門控性鈉離子通道(Voltage-gated sodium channels,VGSCs)是由1個α亞基和4個β亞基構(gòu)成的蛋白復(fù)合體，SCN1A-SCN11A基因編碼的α亞基為功能亞基，共有9種亞型(Nav1.1～Nav1.9)[3]。VGSCs既可以在興奮細(xì)胞中表達(dá)，也可以在“非興奮”細(xì)胞和組織中表達(dá)，如：結(jié)直腸癌[4]、乳腺癌[5]、卵巢癌[6]及前列腺癌[7]等，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是VGSCs的特異性抑制劑，根據(jù)VGSCs對TTX的敏感性，VGSCs分為TTX敏感型(TTX-S)和TTX耐受型(TTX-R)。有研究發(fā)現(xiàn)，Nav1.5在結(jié)腸癌組織較正常組織呈高表達(dá)，并與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲勢能有關(guān)[9]，但其在CRC耐藥細(xì)胞中表達(dá)情況及其與轉(zhuǎn)移勢能的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究通過比較結(jié)直腸癌親本細(xì)胞SW620和耐藥細(xì)胞SW620/OxR 的Nav1.5功能及蛋白表達(dá)的差異，探討Nav1.5功能變化對CRC耐藥細(xì)胞侵襲、遷移的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。 Leibovitz's L-15 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自上海依科賽公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國Corning公司；CCK8試劑盒購自ATGene公司；奧沙利鉑(Oxaliplatin，Oxa)、5-氟尿嘧啶(5-fluorocrail,5-FU)和小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司；河豚毒素(TTX)、兔抗人P-gp抗體購自美國Abcam公司；兔抗人Nav1.5單克隆抗體由以色列Alomone公司惠贈；PVDF膜(0.45 μm)和Transwell 小室(孔徑8 μm)均購自美國 Millipore公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京百泰克公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞建立 人結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞使用含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺的Leibovitz's15(L-15)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(37 ℃，0% CO2飽和濕度)。采用濃度遞增法，逐漸增加L-15培養(yǎng)液中OxR的濃度直至臨床血漿濃度(2 μmol/L)，建立慢性抵抗OxR的SW620/OxR細(xì)胞株[10]。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 實驗設(shè)置分組：SW620組、SW620/OxR組及5-FU或TTX干預(yù)組。干預(yù)組為用含2.0 μg/mL 5-FU或30 μmol/L TTX的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h的SW620 和SW620/OxR細(xì)胞。

1.3.2 CCK-8法細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞SW620和SW620/OxR均以5×103/孔，接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)中，待細(xì)胞貼壁生長約70%后，分別加入含2.0 μg/mL 5-FU或30 μmol/L TTX或2 μmol/L Oxa繼續(xù)培養(yǎng)72 h，設(shè)置調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)液和CCK-8)，以不含干預(yù)藥物的細(xì)胞孔為對照，每組設(shè)5個復(fù)孔。在既定時間每孔加10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測A450 nm的吸光度值(OD值)，以吸光度值反應(yīng)細(xì)胞增殖力。

1.3.3 細(xì)胞遷移實驗 采用孔徑為8 μm的Transwell小室進(jìn)行實驗，取5×104/mL的單細(xì)胞懸液200 μL加入小室內(nèi)室，下室加入500 μL含10% FBS的L-15培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h，取出小室PBS洗滌2次， 加4% 多聚甲醛固定20 min，再用5%結(jié)晶紫溶液染色20 min，棉棒拭去未透膜細(xì)胞。倒置顯微鏡下隨機選取5個高倍視野拍照、計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 細(xì)胞侵襲實驗 配置濃度為 25%的Matrigel 膠工作液包被Transwell小室，放回培養(yǎng)箱中靜置1 h，L-15水化小室濾膜。后續(xù)實驗步驟同細(xì)胞遷移實驗。

1.3.5 Na+電流檢測 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)被用于結(jié)直腸癌細(xì)胞膜Na+電流水平檢測。選取對數(shù)期生長的SW620、SW620/OxR及TTX干預(yù)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并計數(shù)，接種于35×10 mm的培養(yǎng)皿，37℃、100% 濕度及無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁。去除培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，將細(xì)胞外液加入培養(yǎng)皿后置于倒置顯微鏡下，三維操縱儀移動電極，伸向細(xì)胞表面，加壓形成1 GΩ水平以上的高阻抗封接，破膜，形成全細(xì)胞記錄的形式，予不同參數(shù)的鉗制電壓觀察電流的變化，用Origin軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.6 Western blot檢測P-gp和Nav1.5蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，BAC法測定蛋白濃度，6% 和10% SDS-PAGE電泳后，恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，含10%PBST脫脂奶粉室溫封閉1 h，與兔抗人抗體Nav1.5(1∶500)、兔抗人抗體P-gp(1∶2 000)及鼠抗人抗體β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，再以過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑顯影，BIO-RAD全自動圖像采集圖像，Quantity Qne軟件分析目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CRC耐藥細(xì)胞株的鑒定 CCK-8法結(jié)果分析顯示，奧沙利鉑(OxR，2 μmol/L)和5-氟尿嘧啶(5-FU，2.0 μg/mL)對SW620/OxR細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用(0.940±0.078，0.941±0.037，P均> 0.05)，卻能顯著抑制SW620細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.447±0.049，0.515±0.023，P均<0.05，見圖1)；SW620/OxR與SW620細(xì)胞增殖能力也無明顯差異(P>0.05，見圖1)。Western blot結(jié)果也顯示，SW620/OxR細(xì)胞P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表達(dá)水平較SW620細(xì)胞顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.20±0.06，0.60±0.07，P<0.05，見圖2)。

*：與對照組相比，OxR組和5-FU組對SW620/OxR細(xì)胞，SW620細(xì)胞的增殖比較，P<0.05。 圖1 OxR與5-FU對CRC細(xì)胞增殖力的影響

*：SW620/OxR細(xì)胞與SW620細(xì)胞P-gp蛋白水平比較，P<0.05。圖2 CRC細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)水平

2.2 CRC細(xì)胞Na+電流密度及Nav1.5蛋白表達(dá)水平變化 采用10 μmol/L濃度的TTX抑制SW620 和 SW620/OxR細(xì)胞-10 mV的Na+電流密度，以排除其它因素對Nav1.5通道的干擾(見圖3A、3B)。膜片鉗檢測結(jié)果顯示，與SW620細(xì)胞比較，SW620/OxR細(xì)胞膜 Na+電流水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3C～F)。Western blot結(jié)果也顯示，相較于 SW620細(xì)胞,SW620/OxR細(xì)胞Nav1.5蛋白表達(dá)水平也顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

*：SW620/OxR細(xì)胞與SW620細(xì)胞電流密度對比，P <0.05，pA代表電流單位，mV代表電壓單位。圖3 CRC細(xì)胞在-10 mV出現(xiàn)最大Na+電流密度比較

SW620/OxR細(xì)胞與SW620細(xì)胞Nav1.5蛋白表達(dá)水平對比。圖4 CRC細(xì)胞Nav1.5表達(dá)水平

2.3 TTX對CRC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及Nav1.5蛋白表達(dá)水平的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，30 μmol/L的TTX對SW620細(xì)胞和SW620/OxR細(xì)胞72 h的增殖力均無顯著影響(P>0.05，見圖5A )；遷移實驗卻顯示，SW620/OxR細(xì)胞遷移力較SW620細(xì)胞顯著增加(P<0.05，見圖5B)，TTX均能顯著降低SW620細(xì)胞和SW620/OxR細(xì)胞的遷移力(P均<0.05，見圖5B)。侵襲實驗顯示，SW620/OxR細(xì)胞的侵襲力較SW620細(xì)胞明顯增加，TTX均能顯著降低SW620細(xì)胞和SW620/OxR細(xì)胞的侵襲力(P<0.05，見圖5C)。 Western blot結(jié)果顯示，TTX均能顯著下調(diào)SW620細(xì)胞和SW620/OxR細(xì)胞Nav1.5蛋白表達(dá)水平(P<0.05，見圖5D)。

*：SW620/OxR細(xì)胞與SW620細(xì)胞遷移力對比，SW620/OxR細(xì)胞與SW620細(xì)胞侵襲力對比，P<0.05；△：TTX干預(yù)后，SW620/OxR細(xì)胞與SW620細(xì)胞遷移力比較，TTX干預(yù)后，SW620/OxR細(xì)胞與SW620細(xì)胞侵襲力比較，P<0.05；A:增殖；B：遷移；C：侵襲力；D：Nav1.5蛋白表達(dá)。圖5 TTX對CRC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及Nav 1.5蛋白表達(dá)的影響

3 討論

VGSCs是一種含有形成孔洞的α亞基和較小的、不形成孔洞的β亞基組成的異聚膜蛋白復(fù)合體，α亞基是其功能部分，β亞基具有調(diào)節(jié)α亞基在細(xì)胞表面表達(dá)及α亞基的門控的功能[11]。VGSCs除在心肌、神經(jīng)等可興奮細(xì)胞表達(dá)外，也可在“非興奮”腫瘤組織中表達(dá)[4-7]，并與部分腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。轉(zhuǎn)移是CRC治療失敗的最主要原因，而腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲是CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，有研究發(fā)現(xiàn)Nav1.5在結(jié)腸癌組織呈高表達(dá)，且是CRC細(xì)胞促進(jìn)侵襲基因網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)控因子[12]。然而，關(guān)于Nav1.5表達(dá)與CRC多藥耐藥的關(guān)系及其對CRC耐藥細(xì)胞遷移、侵襲的影響尚不清楚。

多藥耐藥(MDR)是導(dǎo)致腫瘤化療和治療失敗的重要因素之一[13]。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是由MDR1基因編碼的一種轉(zhuǎn)運體，通過影響腫瘤細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運在MDR中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，對奧沙利鉑耐藥的SW620/OxR細(xì)胞對5-氟尿嘧啶也產(chǎn)生耐藥，P-gp表達(dá)水平也顯著增加，與課題組以前研究報道一致[10]。Baptista-Hon等[14]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞表達(dá)成人型和新生兒型Nav1.5變異體，兩者均有相似的穩(wěn)定失活狀態(tài)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nav1.5在轉(zhuǎn)移性CRC親本細(xì)胞SW620和耐藥細(xì)胞SW620/OxR均有表達(dá)，SW620/OxR細(xì)胞Nav1.5表達(dá)水平及細(xì)胞膜Na+電流水平均顯著高于SW620細(xì)胞，提示SW620/OxR細(xì)胞Na+電流增加可能源于Nav1.5表達(dá)上調(diào)，Nav1.5可能參與CRC多藥耐藥過程。House等[15]研究表明，來自同一結(jié)腸癌患者的原發(fā)灶SW480細(xì)胞Nav1.5表達(dá)水平低于轉(zhuǎn)移灶SW620細(xì)胞。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)，來自同一SW620的親本細(xì)胞Nav1.5蛋白表達(dá)水平明顯低于耐藥細(xì)胞。由此可見，Nav1.5在CRC不同階段及不同狀態(tài)表達(dá)不同，這可能與CRC 細(xì)胞部分生物學(xué)特性有關(guān)。Brackenbury 等[16]等研究顯示，Nav1.5在轉(zhuǎn)移性三陰(缺乏雌激素受體、孕激素受體和HER2)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)，且在體外能通過細(xì)胞外基質(zhì)增強癌細(xì)胞的遷移和侵襲力。此外，Nelson等[17]研究顯示，在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤中，鈉通道抑制劑苯妥英鈉能抑制其向肝臟及肺臟的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；A-803467作為一種強效的選擇性Nav1.8鈉通道阻滯劑[18]，對ABCG 2介導(dǎo)的MDR有明顯的抑制作用，也能顯著提高H460/MX20(由人非小細(xì)胞肺癌親本H460細(xì)胞通過逐步增加MX誘導(dǎo)的高表達(dá)ABCG2的耐藥細(xì)胞株)細(xì)胞對ABCG2底物米托蒽醌及拓?fù)涮婵档拿舾行约霸鰪娡負(fù)涮婵祵β闶笠浦擦龅目鼓[瘤作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，SW620/OxR細(xì)胞的遷移力和侵襲力均較SW620細(xì)胞顯著增加，而兩種細(xì)胞的增殖力卻無顯著差異，提示CRC耐藥細(xì)胞的遷移力和侵襲力增加可能與耐藥細(xì)胞Nav1.5蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Baptista-Hon等[14]研究表明，VGSCs抑制劑羅哌卡因能抑制轉(zhuǎn)移性CRC SW620細(xì)胞的侵襲和Nav1.5通道的活性。為進(jìn)一步明確Nav1.5功能與CRC細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系，本研究應(yīng)用鈉通道抑制劑TTX，觀察其對兩種CRC細(xì)胞的Nav1.5表達(dá)、Na+電流及遷移和侵襲的的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，30 μmol/L的TTX能顯著降低親本和耐藥細(xì)胞的遷移及侵襲力，且下調(diào)兩種細(xì)胞的Nav1.5表達(dá)水平及降低兩種細(xì)胞的Na+電流水平，這進(jìn)一步提示了Nav1.5能促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移及侵襲，及Nav1.5抑制劑TTX抑制CRC細(xì)胞遷移、侵襲及Na+電流水平可能與Nav1.5表達(dá)下調(diào)有關(guān)。然而，本研究卻顯示，TTX對SW620和SW620/OxR細(xì)胞的增殖力無顯著影響，由此可見Nav1.5可能不參與CRC細(xì)胞增殖的調(diào)控。目前，雖有研究認(rèn)為Nav1.5編碼基因SCN5A可通過細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期控制基因和Wnt信號通路等調(diào)控CRC細(xì)胞侵襲[15]，但尚無大規(guī)模臨床試驗研究證實VGSCs抑制劑對腫瘤的抑制效應(yīng)[20]。因此，VGSCs抑制劑在抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移方面具有較大的潛能，其有望成為抗腫瘤治療的新型靶向藥物。

綜上所述，CRC耐藥細(xì)胞Na+內(nèi)向電流增加可能源于Nav1.5表達(dá)上調(diào)，并參與CRC的多藥耐藥；Nav1.5能促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移及侵襲，TTX降低CRC細(xì)胞的遷移及侵襲力也可能部分與下調(diào) Nav1.5蛋白表達(dá)有關(guān)。