沈燕，賈舒宇，李紫涵，張徐祥，任洪強(qiáng)

(南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023)

0 前言

2020年2月14日，習(xí)近平總書記提出要把生物安全納入國(guó)家安全體系，現(xiàn)階段全球新冠疫情的暴發(fā)更加凸顯了生物安全的重要性。水環(huán)境是致病菌傳播的重要媒介，水環(huán)境中致病菌引起的傳染病在全球欠發(fā)達(dá)地區(qū)仍頻繁發(fā)生，嚴(yán)重威脅民眾的生命健康安全。由于水環(huán)境中致病菌具有豐度低、種類多和風(fēng)險(xiǎn)異質(zhì)性高等特點(diǎn)，快速準(zhǔn)確檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用是有效控制致病菌傳播的關(guān)鍵之一。近年來(lái)，水環(huán)境中致病菌污染備受關(guān)注，水環(huán)境中常見的致病菌主要包括銅綠假單胞菌、沙門氏菌、志賀氏菌、梭狀芽孢桿菌、軍團(tuán)菌和分枝桿菌等[1-2]，其可通過(guò)呼吸道、消化道和皮膚進(jìn)入人體并引起結(jié)核病、傷寒、霍亂和痢疾等多種疾病[3-7]。與此同時(shí)，耐藥致病菌如金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和結(jié)核分枝桿菌等也在水環(huán)境中大量檢出[8-11]。這些致病菌一般不是水體土著微生物，大部分來(lái)自外源污染[12]。攜帶大量致病菌的污水直接排放或未經(jīng)徹底處理進(jìn)入受納水體，易擴(kuò)散至水源水，進(jìn)而進(jìn)入飲用水處理與管網(wǎng)系統(tǒng)[13-15]。由此可見，水環(huán)境已成為致病菌傳播的重要媒介。水環(huán)境中致病菌通過(guò)飲水和直接接觸等途徑感染人體，存在傳播各類疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在資源匱乏的國(guó)家甚至在發(fā)達(dá)國(guó)家的欠發(fā)達(dá)農(nóng)村地區(qū)，受致病菌污染的水體導(dǎo)致了多種介水疾病的暴發(fā)與流行, 并且介水傳染病的發(fā)病率和死亡率是巨大的[3-4, 16-17]，嚴(yán)重威脅著公眾健康和生態(tài)安全。長(zhǎng)期以理化污染指標(biāo)為主的水質(zhì)監(jiān)測(cè)難以預(yù)測(cè)人類水源相關(guān)致病菌的存在，而傳統(tǒng)的水環(huán)境致病菌檢測(cè)主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)和生化鑒定法，其操作煩瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且樣品中的干擾物會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)致病菌檢出率下降。目前，水環(huán)境中致病菌的監(jiān)測(cè)主要基于對(duì)糞便指示菌(FIB)的檢測(cè)，該方法易于應(yīng)用且成本較低，但檢測(cè)結(jié)果與致病菌間的相關(guān)性較差。因此，水環(huán)境致病菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法亟須建立，其在水質(zhì)監(jiān)測(cè)和微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中發(fā)揮著重要作用，是水安全目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的重要基礎(chǔ)[18]。例如，2010年海地霍亂暴發(fā)的前2年，由于缺少水域中霍亂弧菌的分布和歸趨信息，霍亂患者數(shù)量高達(dá)60多萬(wàn)，其中7 000多人死亡。2年后，Kahler等[19]采用培養(yǎng)法、聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)和直接活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)水環(huán)境中的霍亂弧菌并將其濃度數(shù)據(jù)與流行病學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合，用于后續(xù)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，有效地控制了致病菌的傳播，體現(xiàn)了長(zhǎng)期以理化污染指標(biāo)為主的水質(zhì)監(jiān)測(cè)向環(huán)境健康監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)體系轉(zhuǎn)變的重要性。

近年來(lái)，水環(huán)境中致病菌檢測(cè)的相關(guān)研究越來(lái)越多，其中分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，在水環(huán)境中致病菌的鑒定與檢測(cè)中扮演著重要角色，但相關(guān)研究進(jìn)展分析總結(jié)的報(bào)道較少。因此，現(xiàn)總結(jié)了水環(huán)境中主要致病菌及其導(dǎo)致的疾病，重點(diǎn)介紹了近年來(lái)水環(huán)境中致病菌的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，剖析了不同檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用特點(diǎn)，以期為高效便捷的致病菌檢測(cè)方法研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 水環(huán)境中致病菌及相關(guān)疾病

世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示水傳播疾病(主要是急性腸胃炎)每年造成220多萬(wàn)人死亡[20]。水中病原體出現(xiàn)的原因包括：水污染、易感人群增加、飲用水處理不達(dá)標(biāo)、商業(yè)和旅游全球化等[21]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前約有1 400多種病原體會(huì)感染人類，其中包括細(xì)菌(538種)、病毒(208種)、原生動(dòng)物(57種)、真菌及寄生蟲[22]。其中，能引起人類和動(dòng)物患病的細(xì)菌統(tǒng)稱為病原菌或致病菌。致病菌的致病作用與其毒力、侵入機(jī)體數(shù)量、侵入途徑及機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[7, 23]。水環(huán)境中主要致病菌及其導(dǎo)致的疾病見表1。

表1 水環(huán)境中主要致病菌及其相關(guān)疾病

導(dǎo)致介水傳染病的典型致病菌包含：(1)霍亂弧菌，其產(chǎn)生的腸毒素是一種劇烈的致泄毒素。該毒素作用于腸壁促使腸黏膜細(xì)胞極度分泌從而使水和鹽過(guò)量排出，導(dǎo)致嚴(yán)重脫水虛脫，進(jìn)而引起代謝性酸中毒和急性腎功能衰竭[24]；(2)沙門氏菌，菌體通過(guò)毒力島、黏附素、鞭毛等毒力因子入侵腸上皮細(xì)胞，可導(dǎo)致全身擴(kuò)散感染，典型癥狀包括發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉及腹部絞痛等[25]；(3)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，人和多種動(dòng)物的感染性腹瀉的重要病原，會(huì)引起胃腸道感染、尿道感染、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎以及敗血型感染等[26]。1991—2002年，美國(guó)暴發(fā)了 207 起介水傳染病，主要致病因子為沙門氏菌、霍亂弧菌、軍團(tuán)菌屬、大腸桿菌O157:H7 和空腸彎曲桿菌等致病菌和寄生蟲，共計(jì)433 947人患病[27]。2008—2013 年，菲律賓共有42 071例霍亂病例，主要致病因子為霍亂弧菌[28]。中國(guó)每年腸道傳染病的發(fā)病率為 97.33例/10萬(wàn)人，主要包括霍亂、傷寒、細(xì)菌性痢疾等腸道傳染病[29]。由此可見，這些介水傳染病具有發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣和危害嚴(yán)重等特點(diǎn)。

2 水環(huán)境中致病菌的檢測(cè)技術(shù)

近年來(lái)，水環(huán)境中致病菌的檢測(cè)取得了一定的研究進(jìn)展，已從單一基于培養(yǎng)法的傳統(tǒng)致病菌檢測(cè)方法發(fā)展至多種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，這些技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為致病菌檢測(cè)提供了新的思路。水環(huán)境中致病菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程見圖1。

目前最普遍的致病菌檢測(cè)方法是培養(yǎng)法[60]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)。這2種方法在選擇性和靈敏度方面都很突出，但培養(yǎng)法比PCR法更耗時(shí)[61]。一些新興的方法如生物傳感器正在開發(fā)中，其未來(lái)的發(fā)展方向是滿足低成本、高選擇性要求[62-64]。高通量測(cè)序由于通量高和無(wú)須特異性引物等優(yōu)點(diǎn)正逐漸取代傳統(tǒng)檢測(cè)方法，但也存在錯(cuò)誤率高等局限性[65-66]。近年來(lái)致病菌檢測(cè)方法的檢測(cè)限及其應(yīng)用見表2。目前，致病菌檢測(cè)方法還存在相似亞種難以區(qū)分、致病性及樣品濃縮帶來(lái)的抑制物等問(wèn)題，這對(duì)新檢測(cè)方法的開發(fā)是重大挑戰(zhàn)[31]。

圖1 水環(huán)境中致病菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程

表2 致病菌檢測(cè)方法的檢測(cè)限及其應(yīng)用

續(xù)表

續(xù)表

2.1 PCR和實(shí)時(shí)定量PCR

PCR是目前致病菌檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的分子生物學(xué)方法之一，其通過(guò)擴(kuò)增特定的靶基因序列來(lái)完成致病菌檢測(cè)。主要通過(guò)變性、退火和延伸(退火和延伸也可以同時(shí)進(jìn)行)3個(gè)步驟最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的指數(shù)放大。中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 1896—2007)中采用PCR技術(shù)對(duì)食品中的多種致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌 O157:H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌)進(jìn)行快速定性檢測(cè)。

實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上利用熒光信號(hào)值實(shí)時(shí)檢測(cè)目的基因，通過(guò)內(nèi)參或外參法對(duì)樣品中的特定基因進(jìn)行定量分析，比常規(guī)PCR更為靈敏。已有大量研究采用qPCR方法定量致病菌，如大腸桿菌[71]和沙門氏菌[74]等。Hassard等[61]分別采用qPCR方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)河口水樣中大腸桿菌和腸球菌，發(fā)現(xiàn)qPCR方法的檢測(cè)限能達(dá)到1 CFU/100 mL，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。但是qPCR也存在DNA回收效率低和對(duì)引物特異性要求高的問(wèn)題[61]。此外，qPCR在檢測(cè)中還面臨其他一些挑戰(zhàn)，如反應(yīng)中存在PCR抑制物[93]。即使少量的PCR抑制物也會(huì)延遲復(fù)雜樣品的閾值循環(huán)(Cq)，從而導(dǎo)致模板拷貝數(shù)比實(shí)際值低。為防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，可在PCR反應(yīng)中加入對(duì)抑制物具有高靈敏度的內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(如內(nèi)參基因)進(jìn)行檢測(cè)。此外，提取過(guò)程中殘留的抑制物如胍鹽和苯酚可采用QuickDrop和NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)，也可以通過(guò)凝膠電泳確定是否有RNA、DNA及蛋白污染。如果樣品中含有蛋白等其他雜質(zhì)的污染，可以使用磁珠進(jìn)行核酸純化。與此同時(shí)，qPCR無(wú)法識(shí)別活菌或死菌，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[71]。目前，一般采用疊氮溴化丙錠(propidium monoazide, PMA)對(duì)樣品進(jìn)行前處理，從而避免假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。PMA是一種高度光敏的DNA結(jié)合染料，不能透過(guò)完整的活細(xì)胞膜，卻能選擇性地透過(guò)不完整的死細(xì)胞膜。PMA能與DNA結(jié)合形成不可逆共價(jià)鍵，抑制死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增以達(dá)到區(qū)分死、活細(xì)胞的目的[76]。

此外，PCR與qPCR對(duì)于致病菌的批量檢測(cè)存在一定的局限性[94]。針對(duì)上述問(wèn)題，多重 PCR、微滴式數(shù)字PCR等技術(shù)相繼產(chǎn)生。多重PCR(multiplex PCR, mPCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[95]。微滴式數(shù)字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)是第三代 PCR技術(shù)，屬于單分子分析，可用于絕對(duì)定量。Singh等[73]用ddPCR和qPCR計(jì)數(shù)河流環(huán)境中的沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)水中ddPCR的靈敏度和線性范圍與qPCR相當(dāng)，但沉積物樣品中ddPCR的靈敏度和線性范圍明顯更高。多重PCR和微滴式數(shù)字PCR技術(shù)都克服了傳統(tǒng)PCR方法高成本、通量有限、流程復(fù)雜、精確度低等缺點(diǎn)。但是mPCR 存在多目標(biāo)擴(kuò)增條件不相容的問(wèn)題[77]，ddPCR檢測(cè)高濃度樣品時(shí)的線性度明顯下降[71]。

2.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，無(wú)論是實(shí)際操作還是儀器要求方面都比PCR技術(shù)更為簡(jiǎn)單方便，在臨床和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中具有良好的前景，其中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)已經(jīng)得到一定的應(yīng)用。該技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法[96]，其主要原理是使用4條特異性引物分別識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，通過(guò)鏈置換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)等溫條件下基因的快速擴(kuò)增[97]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高(檢測(cè)限比傳統(tǒng)的PCR方法低2～5個(gè)數(shù)量級(jí))、反應(yīng)時(shí)間短(30～60 min)、臨床使用不需要特殊儀器和操作簡(jiǎn)單(反應(yīng)液、酶和模板的混合液置于63 ℃左右水浴鍋或恒溫箱中30～60 min)。Lin等[80]使用改性的LAMP定量分析地表水中的大腸桿菌和傷寒沙門氏菌，靈敏度動(dòng)態(tài)范圍為0.3～10 000 cells/mL，高濃度抑制物對(duì)定量結(jié)果影響較小，且1 h內(nèi)能夠完成檢測(cè)。LAMP技術(shù)基于4～6個(gè)引物的結(jié)合，所以比qPCR擴(kuò)增效率低[74]，也常常因非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[97]。目前常用的防止假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的方法主要包括：(1)使用特定結(jié)構(gòu)的PCR管，該管中有一個(gè)固定的小隔板將管分成2個(gè)區(qū)域，分別加入反應(yīng)液和DNA染料，但這種方法增加了加液次數(shù)，不適用于大批量檢測(cè)；(2)將染料包埋在石蠟中，反應(yīng)結(jié)束后高溫熔化石蠟進(jìn)而釋放染料，但該方法增加了前處理時(shí)間。

此外，重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)[98]、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)[99]、核酸依賴性擴(kuò)增(NASBA)等技術(shù)也在不斷發(fā)展與完善之中。(1)RPA 技術(shù)：主要原理是重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，其能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)，形成并啟動(dòng)DNA合成，從而對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。該方法屬于常溫?cái)U(kuò)增，其靈敏度高、特異性強(qiáng)且檢測(cè)時(shí)間短，可實(shí)現(xiàn)致病菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[100]。但是RPA反應(yīng)中的一些物質(zhì)會(huì)干擾試紙上的抗體，不充分稀釋樣品會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合和假陽(yáng)性信號(hào)[101]。(2)RCA技術(shù)：以環(huán)狀DNA為模板，利用較短的DNA引物(與部分環(huán)狀模板互補(bǔ))在酶催化下將三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)轉(zhuǎn)變成包含成百上千個(gè)重復(fù)的與模板片段互補(bǔ)的單鏈DNA。其具有很強(qiáng)的拓展性，可以進(jìn)行原位擴(kuò)增，但是容易受到復(fù)雜溶液體系的干擾[102]。(3)NASBA技術(shù)：原理是利用定量mRNA確認(rèn)目標(biāo)生物的存在和生存能力。由于NASBA僅擴(kuò)增RNA，樣品中DNA的存在不會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。與此同時(shí)，該方法可以等溫進(jìn)行，減少了對(duì)專用設(shè)備的需求，是環(huán)境樣品常規(guī)監(jiān)測(cè)工具的理想選擇[103]。Fykse等[104]利用NASBA方法檢測(cè)海水中的霍亂弧菌，檢測(cè)限為5×103CFU/100 mL。而Walker等[82]利用NASBA檢測(cè)地表水和海水中的大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)限明顯高于PCR，可能是抑制性物質(zhì)如氯化鈉和其他菌種RNA影響所致。

2.3 生物傳感器

目前，致病菌檢測(cè)不僅對(duì)靈敏度、特異性、檢測(cè)限、檢測(cè)時(shí)間、操作復(fù)雜程度和人員培訓(xùn)等關(guān)鍵問(wèn)題具有較高要求，對(duì)經(jīng)濟(jì)高效的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)設(shè)備的需求也越來(lái)越高，因此生物傳感器逐漸應(yīng)用于致病菌的快速檢測(cè)[31]。生物傳感器是一種將生物物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器，有多種分類方式[105-106]：(1)根據(jù)分子識(shí)別元件可分為酶?jìng)鞲衅鳌⑽⑸飩鞲衅?、?xì)胞傳感器、組織傳感器和免疫傳感器；(2)根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器可分為生物電極傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、光生物傳感器、熱生物傳感器、壓電晶體生物傳感器和聲學(xué)生物傳感器；(3)根據(jù)輸出電信號(hào)的測(cè)量方式可分為電位型生物傳感器、電流型生物傳感器和伏安型生物傳感器；(4)根據(jù)被測(cè)目標(biāo)與分子識(shí)別元件的相互作用方式可分為生物親和型生物傳感器、代謝型或催化型生物傳感器。

在檢測(cè)復(fù)雜水質(zhì)時(shí)，識(shí)別元件與待測(cè)微生物的不可逆性化學(xué)反應(yīng)會(huì)降低識(shí)別元件的識(shí)別能力，影響傳感器的靈敏度[107]。適配體的引入及其在傳感技術(shù)中的廣泛應(yīng)用可有效增強(qiáng)致病菌檢測(cè)的敏感性[108]。核酸適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能與相應(yīng)的配體進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合。Jin等[83]開發(fā)了一種基于納米粒子與適配體結(jié)合的生物傳感器來(lái)檢測(cè)大腸桿菌 ATCC 8739，該檢測(cè)器的檢測(cè)范圍為5～1×106CFU/mL，檢測(cè)限為3 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間<20 min。Altintas等[107]開發(fā)了基于微流體的全自動(dòng)電化學(xué)生物傳感器并對(duì)磷酸鹽緩沖液(PBS)中的大腸桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其檢出限低至50 CFU/mL且特異性高。此外，其分析地表水樣時(shí)的檢測(cè)限與模擬實(shí)驗(yàn)相同，但傳感器信號(hào)略有下降。生物傳感器在致病菌收集和檢測(cè)之間幾乎沒(méi)有時(shí)間延遲[63]，但在檢測(cè)過(guò)程中存在細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致薄膜阻抗增加、革蘭氏陰性菌檢測(cè)限高和光流控傳感器靈敏度低等問(wèn)題[109]。

2.4 DNA微陣列技術(shù)

微流體技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，該技術(shù)精確地控制流體的性能，并將流體限制在一個(gè)很小的幾何尺度(通常為亞毫米)內(nèi)，進(jìn)而產(chǎn)生了芯片實(shí)驗(yàn)室或DNA微陣列技術(shù)[110]。DNA微陣列技術(shù)又稱DNA陣列或DNA芯片，一般用于檢測(cè)不同生長(zhǎng)條件下細(xì)胞基因的表達(dá)、DNA序列的特異性突變或者表征環(huán)境樣品中微生物的特征[111]。DNA微陣列含有高密度固定化核酸(基因組DNA、cDNA或寡核苷酸)的有序二維矩陣，能夠通過(guò)核酸雜交同時(shí)檢測(cè)單個(gè)樣品中的數(shù)百個(gè)基因[112]，也可以同時(shí)快速檢測(cè)多個(gè)生物體的多個(gè)基因。該方法能夠篩選大量序列[113]，具有很強(qiáng)的自動(dòng)化能力，并且具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單和檢測(cè)設(shè)備簡(jiǎn)單易于攜帶的優(yōu)勢(shì)。張子龍等[87]開發(fā)了一種能檢測(cè)12種食源致病菌的芯片，其特異性良好且檢測(cè)限低至1 CFU/mL。Ramalingam等[114]設(shè)計(jì)了基于實(shí)時(shí)PCR的微陣列芯片，該芯片能夠同時(shí)檢測(cè)4種水生致病菌(銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌)。但是，目前該方法成本相對(duì)較高，不能區(qū)分待檢樣品中的活、死菌且樣品量消耗非常大[113]。此外，還可能產(chǎn)生非特異性雜交，導(dǎo)致特異性和敏感性降低[115-116]。而DNA微陣列與靶基因PCR擴(kuò)增相結(jié)合能夠提高致病菌檢測(cè)的靈敏度，即將PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因產(chǎn)物雜交到一個(gè)低密度的DNA芯片上進(jìn)行檢測(cè)，信號(hào)靈敏度能夠增加約1×106倍[115]。

2.5 高通量測(cè)序技術(shù)

近幾年，高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing, HTS)的開發(fā)與應(yīng)用促進(jìn)了宏基因組學(xué)的發(fā)展。HTS可以讀取數(shù)10億的環(huán)境樣品DNA 序列(reads)，分析微生物群落組成及功能[11]。目前，第二代測(cè)序技術(shù)是最主流的測(cè)序技術(shù)[117]，測(cè)序平臺(tái)主要有Ion Torrent(ABI 公司)、Miseq和Hiseq(Illumina 公司)[118]、454(Roche 公司)[119]。高通量測(cè)序流程一般分為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程(包括樣品處理、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)控和上機(jī)測(cè)序)和生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)分析流程(包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列比對(duì)、注釋和變異識(shí)別)[120]，其中文庫(kù)質(zhì)控是提高測(cè)序準(zhǔn)確率的關(guān)鍵。此外，HTS存在一定的系統(tǒng)誤差，可通過(guò)增加測(cè)序深度進(jìn)行校正，另一方面，測(cè)序深度在一定程度上與基因組覆蓋度正相關(guān)，即測(cè)序深度增加，基因組覆蓋度也會(huì)提高。

目前，HTS 主要利用特異性標(biāo)記基因、毒力因子和16S rRNA 基因鑒定致病菌。(1)特異性標(biāo)記基因：使用特異性標(biāo)記基因的代表工具是MetaPhlAn2，數(shù)據(jù)庫(kù)含有17 000多個(gè)參考基因組(包括13 500個(gè)細(xì)菌和古菌、3 500個(gè)病毒和110種真核生物)和多達(dá)100萬(wàn)類群特異的標(biāo)記基因，可以實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的分析[121]。目前，運(yùn)用此方法分析環(huán)境致病菌的研究很多[116, 122]。Li等[65]開發(fā)了適用于溪流水樣的mPCR-HTS方法，該方法利用HTS的高測(cè)序深度顯著提高了mPCR的多重水平。Wolf-Baca等[118]通過(guò)HTS技術(shù)分析了供水系統(tǒng)中細(xì)菌物種的多樣性，發(fā)現(xiàn)變形桿菌(40%～97%)是優(yōu)勢(shì)菌且檢測(cè)到梭狀芽孢桿菌屬和腸桿菌科致病菌。(2)毒力因子：基于毒力因子的鑒別方法廣泛應(yīng)用于致病菌鑒別，應(yīng)用較多的是利用細(xì)菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(VFDB)中毒力因子確定致病菌[123]，但是VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中致病菌種類較少，且大多數(shù)毒力因子在致病菌中不作為特異性基因存在。(3)16S rRNA 基因：目前基于16S rRNA基因鑒定致病菌的應(yīng)用最廣泛，16S rRNA是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，包含約50個(gè)功能域，存在于所有原核微生物的基因組中，具有高度的保守性和特異性[124]。將細(xì)菌16S rRNA序列測(cè)序結(jié)果與不斷更新完善的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可以獲得致病菌在屬和種水平的分類信息，從而快速準(zhǔn)確地判斷致病菌的歸趨[116, 125]。但該方法過(guò)度依賴引物的質(zhì)量[126]，導(dǎo)致PCR過(guò)程中存在固有的擴(kuò)增偏差[127]。此外，由于同一屬內(nèi)的16S rRNA基因拷貝數(shù)不盡相同，定量結(jié)果和實(shí)際數(shù)量會(huì)有差異。由于序列長(zhǎng)度原因，盡管使用很嚴(yán)格的篩選條件，HTS也可能存在序列比對(duì)上的錯(cuò)誤[128]。總體來(lái)說(shuō)，采用基于第二代高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)方法檢測(cè)致病菌存在精度和準(zhǔn)度不高的問(wèn)題，但是其數(shù)據(jù)通量高。

隨著第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，其弊端正在顯現(xiàn)，而第三代測(cè)序技術(shù)在一定程度上可以彌補(bǔ)其在應(yīng)用中的一些不足。第三代測(cè)序技術(shù)是指單分子測(cè)序技術(shù)，不需進(jìn)行PCR擴(kuò)增也能實(shí)現(xiàn)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序。其實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)幾千個(gè)堿基的長(zhǎng)序列。技術(shù)平臺(tái)主要有Heliscope/Helicos(Helicos公司)、SMRT(Pacific Biosciences公司)、MinION/GridION/PromethION(Oxford Nanopore Technologies公司)。由于長(zhǎng)讀長(zhǎng)的特點(diǎn)，測(cè)序平臺(tái)在基因組測(cè)序中能降低測(cè)序后的重疊群(contig)數(shù)量，明顯減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量，節(jié)省大量的時(shí)間[66]，因此第三代測(cè)序在鑒定新的病原體和細(xì)菌基因組測(cè)序方面得到了廣泛的應(yīng)用。Hamner等[92]利用MinION設(shè)備對(duì)河流中存在的水傳播疾病病原體進(jìn)行宏基因組分析，檢測(cè)到大腸桿菌血清型O104:H4和O1群El Tor型霍亂弧菌等人類致病菌。單分子測(cè)序一般存在測(cè)序錯(cuò)誤率比較高且隨機(jī)的問(wèn)題，但可以通過(guò)多次測(cè)序進(jìn)行有效糾錯(cuò)[91]。有研究表明[129-130]，MinION測(cè)序方法優(yōu)化后的準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上，可以滿足致病菌的檢測(cè)需要。

3 總結(jié)與展望

3.1 研究進(jìn)展

近年來(lái)，核酸分子擴(kuò)增和雜交等分子生物學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于水環(huán)境致病菌檢測(cè)中，高通量測(cè)序技術(shù)在致病菌的鑒定及定量領(lǐng)域也處于快速發(fā)展階段，基于分子生物學(xué)的快速、靈敏和準(zhǔn)確的致病菌檢測(cè)技術(shù)是健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵。綜上所述，水環(huán)境中致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展主要包括：(1)檢測(cè)對(duì)象從原來(lái)的糞源指示菌和少數(shù)幾種腸道病原菌轉(zhuǎn)變?yōu)橐阎虏【?、不可培養(yǎng)和新出現(xiàn)的致病菌；(2)水環(huán)境致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)通量、靈敏度、特異性和重復(fù)性等快速進(jìn)步，檢測(cè)技術(shù)種類不斷豐富；(3)分子生物學(xué)檢測(cè)儀器由原來(lái)的手工、半自動(dòng)發(fā)展到標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)設(shè)備，自動(dòng)化程度越來(lái)越高，檢測(cè)速度快、通量高且經(jīng)濟(jì)成本不斷下降。

目前，基于分子生物學(xué)的致病菌檢測(cè)技術(shù)可在水環(huán)境監(jiān)測(cè)中廣泛應(yīng)用。水環(huán)境監(jiān)測(cè)業(yè)務(wù)化應(yīng)用過(guò)程中可根據(jù)不同致病菌檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)，針對(duì)性地選擇檢測(cè)技術(shù)：(1) qPCR具有操作簡(jiǎn)便和靈敏度高的特點(diǎn)，適用于一般地表水和飲用水源的監(jiān)測(cè)，可以定量低豐度的致病菌；(2)LAMP擴(kuò)增效率較低，但具有操作簡(jiǎn)便和檢測(cè)快速的特點(diǎn)，適用于一般地表水的監(jiān)測(cè)；(3)生物傳感器具有專一性強(qiáng)、成本低和攜帶方便等特點(diǎn)，適用于水環(huán)境污染應(yīng)急監(jiān)測(cè)；(4)DNA微陣列技術(shù)自動(dòng)化水平高但靈敏度低，適用于復(fù)雜致病菌群落結(jié)構(gòu)的水污染源與污水處理系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)；(5)高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高和速度快的特點(diǎn)，適用于水污染源與污水處理系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)，可快速識(shí)別復(fù)雜的致病菌群落結(jié)構(gòu)。

3.2 技術(shù)不足

目前，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)仍然存在著以下的一些不足：(1)qPCR檢測(cè)過(guò)程中很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，且對(duì)引物的特異性要求很高；(2)LAMP的擴(kuò)增效率明顯低于qPCR，且假陽(yáng)性/陰性多；(3)生物傳感器在真實(shí)水環(huán)境中存在靈敏度低和檢測(cè)限高的問(wèn)題；(4)DNA微陣列技術(shù)可能產(chǎn)生非特異性雜交，導(dǎo)致檢測(cè)方法的特異性和敏感性較低；(5)測(cè)序技術(shù)正不斷向高通量和長(zhǎng)讀長(zhǎng)發(fā)展，但是第三代測(cè)序技術(shù)目前的測(cè)序錯(cuò)誤率較高。

3.3 未來(lái)展望

基于水環(huán)境中致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和存在的不足，未來(lái)可在以下幾個(gè)方向開展研究工作：

(1)構(gòu)建致病菌核酸樣品制備方法。致病菌核酸樣品質(zhì)量是實(shí)現(xiàn)高靈敏度和特異性檢測(cè)的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的樣品前處理方法具有處理時(shí)間長(zhǎng)和富集系數(shù)低等問(wèn)題，目前亟須構(gòu)建致病菌高效預(yù)濃縮裝備及確定核酸樣品快速無(wú)損制備方法；

(2)明確致病菌定量結(jié)果與實(shí)際數(shù)量間的差異。目前大部分研究將qPCR定量的基因拷貝數(shù)結(jié)果視為細(xì)胞數(shù)量，忽略其與致病菌實(shí)際數(shù)量間的差異?？蓸?gòu)建致病菌單拷貝基因數(shù)據(jù)庫(kù)，以單拷貝基因作為qPCR的標(biāo)志基因?qū)⒍拷Y(jié)果轉(zhuǎn)換為致病菌數(shù)量；

(3)構(gòu)建全面準(zhǔn)確的致病菌數(shù)據(jù)庫(kù)。采用高通量測(cè)序方法檢測(cè)致病菌需將測(cè)序數(shù)據(jù)與致病菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，全面準(zhǔn)確的致病菌數(shù)據(jù)庫(kù)是分析檢測(cè)的關(guān)鍵；

(4)開展致病菌活性檢測(cè)。致病菌活性是其具有感染性的前提條件，也是評(píng)估感染風(fēng)險(xiǎn)的重要參數(shù)。目前水環(huán)境中致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)主要關(guān)注致病菌濃度和多樣性，亟須完善致病菌活性檢測(cè)方法體系和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；

(5)開展致病菌耐藥性檢測(cè)。目前抗生素耐藥性已成為全球關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題，致病菌獲得耐藥性會(huì)導(dǎo)致抗生素有效性下降，越來(lái)越多的感染難以治愈，威脅人類健康。在完成致病菌檢測(cè)的同時(shí)開展致病菌耐藥性分析有助于遏制致病菌耐藥發(fā)展與蔓延；

(6)致病菌檢測(cè)技術(shù)適用性分析及耦合使用。在不斷發(fā)展新技術(shù)的同時(shí)，將不同的致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用到適合的水環(huán)境中，明確更準(zhǔn)確靈敏且有效的檢測(cè)方法。同時(shí)，綜合評(píng)估目前現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)，亟須發(fā)揮各類技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立精準(zhǔn)的耦合檢測(cè)技術(shù)。