顧 嫻，李曉敏，王國(guó)棟，張曉琳，竇曉利*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209）

青貯玉米是將整株玉米或者玉米秸稈在未完全成熟的時(shí)候收割，切成小段，用青貯裝置隔絕空氣密封發(fā)酵后做成的青貯飼料，在飼喂牲畜方面有著重要的意義[1]。青貯后的作物秸稈具有適口性好、容易消化等特點(diǎn)，青貯發(fā)酵過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生許多蛋白質(zhì)、氨基酸等影響物質(zhì)，并且有效抑制有害霉病菌，既能提高牲畜肉的品質(zhì)，還能降低牲畜患病概率[2]；青貯飼料對(duì)原料沒(méi)有嚴(yán)格要求，各種作物的秸稈都可以制作。乳酸菌在青貯發(fā)酵過(guò)程中起到最重要作用的微生物，原料附著的乳酸菌直接影響青貯的品質(zhì)[3]。我國(guó)北方地區(qū)是青貯玉米生產(chǎn)的重要產(chǎn)區(qū)，不同地區(qū)自然條件發(fā)酵的青貯品質(zhì)各不相同，二次發(fā)酵的程度也各不相同，說(shuō)明其中所含的乳酸菌菌種有著一定的差別。挖掘不同地區(qū)的乳酸菌種質(zhì)資源，從中篩選出優(yōu)質(zhì)的適合生產(chǎn)青貯的乳酸菌菌種，對(duì)青貯飼料的生產(chǎn)有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 青貯飼料樣品

通過(guò)親自采樣以及樣品寄送的方法，收集了涵蓋我國(guó)北方大部分地區(qū)的青貯玉米的47個(gè)樣品，其中甘肅省17個(gè)，內(nèi)蒙古自治區(qū)14個(gè)，東北地區(qū)3個(gè)，山東省6個(gè)，河南省3個(gè)，北京、天津和河北地區(qū)共4個(gè)。取樣時(shí)去掉表面和空氣接觸的部分，從深處取樣，樣品立刻用真空包裝機(jī)分裝2～3袋，每袋200～300 g，用冰盒保存，一袋保存于4°冰箱，用作乳酸菌篩選，一袋在-80°冷凍后，測(cè)定其中微生物多樣性，剩下一袋保存在-80°冰箱中備用[4]。

1.2 乳酸菌的分離和篩選

每個(gè)樣品稱(chēng)取10 g，加入250 ml無(wú)菌水中，放入均質(zhì)袋，與均質(zhì)機(jī)上均質(zhì)10 min，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液倒入滅菌的錐形瓶中迅速封口。在厭氧操作臺(tái)進(jìn)行以下操作：用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)幻總€(gè)樣品選取2個(gè)合適的梯度，每個(gè)梯度2個(gè)平行；涂布在MRS平板培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h[5]。根據(jù)菌落的大小、顏色、形狀、光澤度等選擇不同單菌落，在MRS平板培養(yǎng)基上三區(qū)劃線接種，在厭氧培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。重讀劃線3次純化培養(yǎng)，得到單一菌株。挑取純化后的單菌落于液體培養(yǎng)基接種于試管中，同等條件下富集培養(yǎng)，取500 μl與等體積50%甘油混合，保存于速凍管中，于-80°冰箱保存。保種后的菌株再挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其菌體大小、形狀和排列方式[6]。

1.3 乳酸菌的鑒定

采用16S rRNA基因序列進(jìn)行乳酸菌的鑒定。分離的乳酸菌株在平板MRS培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單獨(dú)菌落，混入裝有20 μl無(wú)菌水的EP管，熱激1～2 min，然后振蕩離心后靜置。取上清液作為DNA模板，進(jìn)行16 S rRNA的擴(kuò)增。引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和14892R：5′-TACCTTGTTACGACT，由大連生物公司合成，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度大約為1 500 bp。25 μl體的PCR反應(yīng)體系包括：10×buffe2.5μl，dNTP2.0μl，MgCl2.0μl，正向、反向引物各1.0 μl ，DNA模板2.0 μl，Tag酶0.3 μl，無(wú)菌水14.2 μl。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95℃，2 min；變性，95℃，30 s；退火，55℃，30 s；延伸，72℃，3 min；延伸，72 ℃，10 min；保存，4℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，如果在紫外燈下可見(jiàn)1 500 bp左右的條件[7]，則擴(kuò)增成功，產(chǎn)物送北京生物公司進(jìn)行測(cè)序。

2 數(shù)據(jù)分析

利用BLAST 將所測(cè)定的菌株的16S rRNA序列與GenBank里面的已知細(xì)菌的序列進(jìn)行比對(duì)，尋找與目的基因同源性最高的已知分類(lèi)地位的菌種，可得知所鑒定的菌株的分類(lèi)地位[8]。

2.1 菌粉制作

選擇3株具有代表性的菌株：WW1-1（L.P）、DHL-9（W.）、BY1-1（A.P），通過(guò)菌株的復(fù)壯，轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，接種發(fā)酵罐過(guò)夜發(fā)酵的步驟獲得發(fā)酵液，離心后得到菌泥。菌泥加2倍甘油，加100 g脫脂奶粉，攪拌混勻后鋪在玻璃平板，用錫箔紙包好，先在-80℃冰箱預(yù)凍2～4 h，然后在凍干機(jī)上冷凍干燥24～48 h，得到3株菌株的菌粉，計(jì)數(shù)后備用[9]。

2.2 玉米防霉效果試驗(yàn)

使用新鮮玉米粒，水分測(cè)定儀測(cè)定水分，平衡水分到30%，備用[10]。設(shè)計(jì)6個(gè)處理，具體處理如表1所示。每袋樣品100 g玉米，用透明呼吸袋封口后，常溫放置發(fā)酵。

表1 玉米防霉試驗(yàn)分組

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品的理化性質(zhì)

收集的47個(gè)樣品，保存度都基本完好，色澤以青綠色和黃綠色為主，均具有酸香氣味，質(zhì)地松散，不黏手，少數(shù)樣品有發(fā)霉變質(zhì)情況。均質(zhì)液的pH值在3.2～5.7之間，基本都為酸性，屬于合格的青貯飼料[11]。樣品具體信息見(jiàn)表2。

3.2 微生物多樣性

在采集的47個(gè)青貯樣品中擇優(yōu)選擇33個(gè)樣品，通過(guò)用真菌引物和細(xì)菌引物進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，檢測(cè)樣品的微生物多樣性。結(jié)果表明：真菌含量非常少，說(shuō)明樣品幾乎沒(méi)有霉變。在所有樣品中多樣性最豐富的是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）；其次為變形菌門(mén)（Proteobacteria）如圖1所示。多樣性最豐富的屬乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter），如圖2所示。

表2 47個(gè)玉米青貯樣品感官評(píng)價(jià)與pH值

圖1 樣品實(shí)際結(jié)果群落結(jié)構(gòu)組成圖（門(mén)）

圖2 樣品實(shí)際結(jié)果群落結(jié)構(gòu)組成圖（屬）

3.3 乳酸菌鑒定結(jié)果

鑒定結(jié)果與微生物多樣性檢測(cè)結(jié)果基本一致，典型菌株有植物乳桿菌、布氏乳桿菌、巴氏醋桿菌、魏斯氏球菌等菌種[12]。

典型菌株WW1-1，原料產(chǎn)地為甘肅省武威市，菌落為乳白色圓點(diǎn)，光滑，中間略有凸起，顯微鏡下菌體形態(tài)為短桿狀，鏈接成鏈；PCR鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum）。

典型菌株DHL-9，原料產(chǎn)地為內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市，菌落為乳白色小點(diǎn)，無(wú)凸起，光滑，顯微鏡下菌體形態(tài)球形，聚集成團(tuán)；PCR鑒定為魏斯氏球菌（Weissella）。

典型菌株BY-1，原產(chǎn)地為甘肅省白銀市，菌落為淺白色小點(diǎn)，無(wú)凸起，顯微鏡下菌體形態(tài)為短桿狀，連接成鏈；PCR鑒定為巴氏醋桿菌（Acetobacter Pasteurianus）。

3.4 防霉試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)60 d的保存試驗(yàn)，每隔10 d檢查每組霉變情況，結(jié)果可見(jiàn)前30 d霉變率都比較低，30 d后霉菌大量生長(zhǎng)，霉變率出現(xiàn)了不同的變化趨勢(shì)，除雙乙酸鈉處理的小組以外，各處理均出現(xiàn)不同程度的漲袋和發(fā)霉。防霉效果最好的菌株是 DHL-9（W.），具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 玉米防霉試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)在我國(guó)北方大部分地區(qū)收集青貯玉米飼料，并對(duì)其微生物多樣性進(jìn)行分析，以及對(duì)其中乳酸菌進(jìn)行了分離篩選，選出了具有代表性的若干菌株，制作菌粉，檢驗(yàn)其防霉發(fā)酵的能力，為以后生產(chǎn)青貯玉米發(fā)酵菌劑提供了研究思路和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，具有重要意義。