（銅仁學院，貴州 銅仁 554300）

羊捻轉血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬圓線目、毛圓科、血矛屬線蟲，是一種呈世界性分布的寄生蟲。羊捻轉血矛線蟲病由寄生在羊皺胃當中的捻轉血矛線蟲通過刺穿皺胃黏膜吸食血液引起。該病主要表現(xiàn)為貧血、消瘦等癥狀，有研究表明，100條成蟲每天可吸取約1.5 ml血液，羊嚴重感染時周圍內成蟲可達上千條[1]。如養(yǎng)殖場管理不規(guī)范、環(huán)境控制不當，很容易導致捻轉血矛線蟲病的大規(guī)模爆發(fā)，造成巨大的經濟損失。目前，捻轉血矛線蟲病的診斷主要依靠顯微鏡下觀察和辨認糞便當中的蟲卵來進行確診，不但耗時費力，還需要有一定的蟲卵識別經驗，準確度較差。微衛(wèi)星DAN分子標記（SSR）又稱簡單串聯(lián)重復序列，由1～6個核苷酸組成的重復單位構成，序列片段多集中在100～300 bp之間。微衛(wèi)星DNA分子標記特異性高、操作簡單，且對DNA質量要求不高，對降解較嚴重的DNA也能擴增出質量較高的條帶，在臨床上具有更高的應用價值，被廣泛應用在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、動植物品種鑒定[2]等方面。

林海等利用ITS序列對林麝糞樣中的疑似血矛屬線蟲蟲卵進行鑒定，通過BLAST比對和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定出其均為捻轉血矛線蟲[3]。羅琴等同樣基于ITS序列對野生動物糞便中毛圓線蟲蟲卵進行分子鑒定并建立了特異性PCR檢測方法[4]，陳武等[5]對長頸鹿捻轉血矛線蟲成蟲ITS序列進行測定并進行BLAST比對鑒定。以上均利用ITS序列在GENEBANK數據庫中進行比對達到捻轉血矛線蟲或蟲卵鑒定的目的，因此實際應用價值不高。利用微衛(wèi)星進行物種鑒定在許多家畜及魚類上已有較廣泛的應用，但捻轉血矛線蟲的鑒定鮮有報道。本試驗篩選出兩組可靠的微衛(wèi)星引物用以對捻轉血矛線蟲的分子鑒定，為后期蟲卵鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

羊捻轉血矛線蟲采自屠宰的貴州白山羊皺胃當中，PBS反復沖洗蟲體以去除皺胃污染物，用0.9 %生理鹽水保存。血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），2×PCR Mix（Takara，Premix Taq?（TaKaRa Taq?Version 2.0）），2×PCR Mix（Promega，GoTaq?Master Mixes），1.1×PCR Mix（北京擎科生物技術有限公司，1.1×T3 Super PCR Mix），DNA Marker（Takara，50 bp DNA Ladder （Dye Plus）），捻轉血矛線蟲微衛(wèi)星引物來自殷方媛文獻[6]，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 微衛(wèi)星引物信息

1.2 方法

將采集的若干條捻轉血矛線蟲成蟲混合放入1.5 ml離心管中，并用剪刀剪碎成末狀，按基因組DNA提取試劑盒說明書進行提取。通過梯度PCR篩選引物并進行組合，優(yōu)化二重PCR體系和條件，最終確定兩組可用于鑒定捻轉血矛線蟲的PCR體系。PCR反應體系為PCR Mix 5 μl，上下游引物各0.4 μl，DNA 0.5 μl，dd H2O 3.7 μl，總體積10 μl；PCR程序為95℃ 5 min，95℃ 30 S，退火溫度為梯度30 S，72℃ 30 S，72℃ 5 min，4℃保存。循環(huán)次數30次。3%瓊脂糖上樣。

2 結果

2.1 單重PCR體系的優(yōu)化

試驗設計5個退火溫度（62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃），分別用3對引物（Hcms 15、Hcms 36和Hcms 37）進行梯度PCR擴增。結果表明，Hcms 15引物和Hcms 37最佳退火溫度為62～58℃，Hcms 36引物在62～50℃范圍內均可擴增出較好的條帶。但引物Hcms 37出現(xiàn)非特異性擴增（大小在200～250 bp之間）?？傮w結果顯示，PCR條帶清晰，片段大小在預期范圍內（見圖1）。

圖1 捻轉血矛線蟲成蟲微衛(wèi)星序列單重PCR擴增產物

M為DNA Marker ，1～5為引物Hcms 15，6～10為引物Hcms 36，11～15為引物Hcms 37。每組引物退火溫度依次為62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃。

2.2 二重PCR體系的優(yōu)化

試驗選取5個退火溫度（62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃），分別用3對引物進行兩兩組合，對組合引物Hcms 15和Hcms 36、Hcms 15和Hcms 37、Hcms 36和Hcms 37進行梯度PCR擴增。結果表明，三個引物組合均擴增出預期條帶，Hcms 36和Hcms 37組合由于片段大小相近，因此重合在一起不能分開。Hcms 15和Hcms 37組合由于受Hcms 37的非特異性擴增的影響，仍有一條200～250 bp范圍的不清晰條帶（見圖2）。

圖2 捻轉血矛線蟲成蟲微衛(wèi)星序列二重PCR擴增產物

M為DNA Marker ，1～5為引物Hcms 15和Hcms 36的組合，6～10為引物Hcms 15和Hcms 37的組合，11～15為引物Hcms 36和Hcms 37。每組引物退火溫度依次為62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃。

2.3 特異性檢測

對引物Hcms 15、Hcms36、Hcms 37及兩種組合進行PCR擴增（退火溫度為62℃）。結果顯示，所有條帶均在預期片段大小范圍內，單重PCR和二重PCR結果一致，符合預期結果。引物Hcms 15出現(xiàn)兩條亮度不一的條帶，但都在266～289 bp預期的范圍內，符合微衛(wèi)星標記的特點（見圖3）。

圖3 捻轉血矛線蟲成蟲微衛(wèi)星序列PCR擴增產物特異性檢測

M為DNA Marker ，1～3為引物Hcms 15、Hcms 36和二者的組合，4～6為引物Hcms 15、Hcms 37和二者的組合，退火溫度均為62℃。

2.4 靈敏性檢測

依據優(yōu)化條件，對DNA樣品（濃度為400 ng/ μl）進行20倍梯度稀釋。用Hcms 15和Hcms 36組合進行PCR擴增，結果表明，二重PCR條帶在8號膠孔處仍可分辨出來，因此將最低檢測濃度定為2 ng/ μl（見圖4）。

圖4 PCR靈敏度試驗

M為DNA Marker。1～12號DNA濃度依次為：400 ng/μl、20 ng/μl、10 ng/μl、6.7 ng/μl、5 ng/μl、4 ng/μl、3 ng/μl、2.7 ng/μl 、2 ng/μl、1.3 ng/μl、1 ng/μL和0.8 ng/μl。

2.5 重復性檢測

用3個公司生產的3種PCR Mix對Hcms 15和Hcms 36、Hcms 15和Hcms37兩種組合進行PCR擴增，結果表明，3種PCR Mix均能穩(wěn)定擴增出目的條帶（見圖5）。

圖5 PCR重復性試驗

M為DNA Marker。1～3號引物Hcms 15、Hcms 36的組合，4～6為引物Hcms 15、Hcms 37的組合，退火溫度均為62℃。

3 討論

微衛(wèi)星分子標記能很好地反映生物個體或種群間某種差異特征的DNA片段，是一種基于DNA片段長度多態(tài)性的分子標記技術。目前，在作物上應用微衛(wèi)星標記進行品種鑒定的較多[7，8]，也有在寵物犬中利用微衛(wèi)星進行品種鑒定[9]，但動物中應用最多的仍是線粒體DNA片段或ITS序列等其他分子標記。

單重和二重PCR在較大的溫度范圍內均能擴增出來產物，引物Hcms 37有非特異性擴增，在提高退火溫度的同時，非特異性擴增有所降低，不影響目的條帶的擴增，且非特異性擴增條帶的亮度遠低于目的條帶，因此可作為標記鑒定捻轉血矛線蟲。引物Hcms 15在片段大小范圍內出現(xiàn)了兩條條帶，符合微衛(wèi)星標記的特征，即微衛(wèi)星標記是根據其兩側已知的保守序列進行引物設計，擴增產物包含微衛(wèi)星標記序列在內的片段，片段大小反映的是不同微衛(wèi)星標記重復次數導致的多態(tài)性，為共顯性標記[10]。因此，同一個體捻轉血矛線蟲也可出現(xiàn)兩條長度不同的片段，而本試驗所用到的DNA為捻轉血矛線蟲的混合DAN。

靈敏性檢測試驗表明，二重PCR可擴增出濃度為2 ng/μl的DNA樣品。羅琴[4]等利用ITS區(qū)序列對捻轉血矛線蟲DNA靈敏性檢測低至25.5×10-9ng/μl，遠高于微衛(wèi)星的靈敏度。這可能與兩種分子標記在蟲體內的拷貝數量有關。

4 結論

綜上所述，本試驗建立的二重PCR檢測方法能有效避免捻轉血矛線蟲在糞便蟲卵檢查法中假陽性的出現(xiàn)，有一定的臨床實用價值。