牛 茂，馮先玲，許有誠(chéng)

MG63細(xì)胞對(duì)載辛伐他汀納米膠束攝取的高效液相色譜法測(cè)定*

牛 茂1，馮先玲2，許有誠(chéng)1

（1. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院，廣東 深圳 518055；2. 深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060）

本實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法定量檢測(cè)人成骨樣細(xì)胞—MG63細(xì)胞對(duì)載辛伐他汀納米膠束（SVNs）的攝取情況．首先，建立檢測(cè)SVNs中SV含量的HPLC法，確定色譜條件，并對(duì)該方法的專(zhuān)屬性與準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)．其次，將SVNs與辛伐他?。⊿V）干預(yù)細(xì)胞，在加藥后的不同時(shí)間終止實(shí)驗(yàn)，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，提取胞內(nèi)藥物并用HPLC法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)．結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相比例為30：70（V/V）時(shí)，定量檢測(cè)SVNs中SV含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為=33782-1424.5（2=0.9999），線性范圍為0.2~3.2 μg/mL．該方法專(zhuān)屬性與準(zhǔn)確性均較高，并成功檢測(cè)出了被MG63細(xì)胞攝取到胞內(nèi)的藥物含量．同時(shí)，在加藥早期，SVNs與SV相比，SVNs被MG63細(xì)胞攝取的速度較慢，但胞內(nèi)藥物含量顯著高于SV，SVNs與SV被MG63細(xì)胞攝取存在顯著差異．

辛伐他?。患{米膠束；高效液相色譜法；成骨細(xì)胞；細(xì)胞攝取

辛伐他?。╯imvastatin，SV）可促進(jìn)骨缺損區(qū)域新骨形成[1]，在增加口腔種植修復(fù)患者頜骨骨量及縮短口腔種植體與頜骨發(fā)生骨結(jié)合時(shí)間方面有較大的應(yīng)用前景．但SV作為脂溶性藥物，難溶于水，骨生物利用度極低，且大量使用時(shí)存在潛在的副作用[2,3]，從而嚴(yán)重限制了其在頜骨成骨領(lǐng)域的應(yīng)用．本課題組在前期通過(guò)應(yīng)用納米膠束包載SV，將其改造為載辛伐他汀納米膠束（simvastatin-loaded nanomicelles，SVNs）后，顯著提高了SV的體內(nèi)、外成骨生物學(xué)效能[4,5]，但關(guān)于SVNs顯著提高SV促成骨效能的機(jī)制目前知之較少．

細(xì)胞對(duì)藥物攝取的方式對(duì)藥效發(fā)揮具有重要的影響．脂溶性的小分子藥物如SV大多以被動(dòng)擴(kuò)散的方式，沿著藥物濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞．而載藥納米膠束如SVNs呈水溶性，主要以網(wǎng)格蛋白依賴(lài)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[6-8]．因此，SVNs和SV被成骨細(xì)胞以不同方式攝取是SVNs顯著提高SV促成骨效能的可能機(jī)制之一．

目前，載藥納米膠束的細(xì)胞攝取情況常采用熒光探針代替藥物進(jìn)行間接、定性或半定量的研究[9-11]．這種方法常選擇熒光探針—6-香豆素作為如SV等脂溶性藥物的模型，然后，用納米膠束包載熒光探針，在激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）或流式細(xì)胞儀（Flow cytometer）下觀察不同時(shí)相細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，并用軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而對(duì)該種納米藥物的攝取情況進(jìn)行定性或半定量評(píng)價(jià)．這種采用熒光探針代替實(shí)際藥物對(duì)合成的納米藥物細(xì)胞攝取情況測(cè)定的方法是否真實(shí)可靠是值得商榷的．

高效液相色譜（high-performance Liquid chromatography，HPLC）法憑借其高精度、高靈敏度特性可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)藥物直接進(jìn)行定量研究．本研究應(yīng)用HPLC法實(shí)現(xiàn)了對(duì)MG63細(xì)胞攝取入細(xì)胞內(nèi)的SVNs中SV含量進(jìn)行定量檢測(cè)，為后續(xù)進(jìn)一步研究SVNs被成骨細(xì)胞攝取的方式及機(jī)制打下基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 SVNs的合成及表征

本實(shí)驗(yàn)中使用的SVNs由課題組前期應(yīng)用透析法合成[5]．納米膠束材料為甲氧基聚乙二醇-聚乳酸二嵌段共聚物（methoxy polyethy-lene glycoL-Polylactic acid，mPEG-PLA）（Mn=5000- 3000）．合成的SVNs外型呈球形，粒徑為（26.62±6.02）nm．

1.2 高效液相色譜法檢測(cè)SVNs中SV含量的方法建立

1.2.1 色譜條件

高效液相色譜儀為島津-20AD HPLC系統(tǒng)；色譜柱為KromasiL C18（250×4.6 mm）；通過(guò)參閱文獻(xiàn)，分別選擇0.1%磷酸水溶液（色譜純）和乙腈溶液（色譜純）作為流動(dòng)相A（水相）和流動(dòng)相B（有機(jī)相），兩者比例為35:65和30:70（V/V），通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)擇優(yōu)選擇；進(jìn)樣量為10 μL；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；柱溫為30 ℃．

1.2.2 繪制SV標(biāo)準(zhǔn)曲線

用適量乙腈溶解SV標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為200μg/mL的SV溶液．首先，分別在流動(dòng)相比例為35:65和30:70（V/V）時(shí)，進(jìn)樣200 μg/mL SV溶液10 μL，確定SV主成分峰的保留時(shí)間．其次，分別吸取10、20、40、80 和160 μL溶液用乙腈稀釋到10 mL，制成0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μg/mL系列梯度濃度SV溶液，在上述色譜條件下繪制SV的標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.2.3 確定方法專(zhuān)屬性

分別取SV溶液、SVNs溶液、空白納米粒溶液和空白溶液（乙腈溶液）分別進(jìn)樣10 μL，得色譜圖后觀察空白納米粒溶液和空白溶液是否會(huì)干擾SV和SVNs的檢測(cè)，以確定其方法專(zhuān)屬性的優(yōu)劣．

1.2.4 方法的精密度和回收率

選取0.2、0.8和3.2 μg/mL3個(gè)濃度連續(xù)3 d測(cè)定上述方法的回收率，進(jìn)而測(cè)定該方法的日內(nèi)和日間精密度．

1.3 MG63細(xì)胞對(duì)SVNs攝取的HPLC法定量檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)分為兩組，包括實(shí)驗(yàn)組—載SV納米膠束組（simvastatin-loaded nanomicelle group，SVNG）和對(duì)照組—SV組（free simvastatin group，SVG）．

將MG63細(xì)胞按5×105/孔接種于6孔板上，每孔加完全培養(yǎng)基2 mL，在37 ℃和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸除完全培養(yǎng)基，用預(yù)熱至37 ℃的PBS溶液潤(rùn)洗3次，每孔加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中孵育60 min，按實(shí)驗(yàn)分組加入已預(yù)熱到37 ℃的相應(yīng)藥物（藥物用無(wú)血清培養(yǎng)基配制），SVNG和SVG中SV的濃度為2 μg/mL，分別在5、10、15、30、60、120、180和240 min終止實(shí)驗(yàn)，傾去藥物并用預(yù)冷的PBS溶液快速潤(rùn)洗4次后置于-80 ℃冰箱，反復(fù)凍融細(xì)胞3次使MG63細(xì)胞破裂釋放出攝入胞內(nèi)的SVNs和SV，每孔加入1 mL乙腈溶液提取SV，超聲3 min，10000 r/min離心5 min，取上清液，0.22 μm針孔濾膜過(guò)濾入進(jìn)樣瓶，采用HPLC法定量測(cè)定SVNs和SV的攝入量．

2 結(jié)果與討論

2.1 SVNs中SV含量進(jìn)行定量檢測(cè)

用HPLC法對(duì)SV進(jìn)行檢測(cè)時(shí)常采用梯度洗脫和等度洗脫方式．一般梯度洗脫用于復(fù)雜試樣的檢測(cè)分析，操作較繁瑣[12]．本實(shí)驗(yàn)使用的SV標(biāo)準(zhǔn)品純度在99%以上，更適用于等度洗脫方式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)．在采用HPLC法檢測(cè)SV時(shí)，流動(dòng)相A與B的比例是需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整的，兩者的比例一般在30:60-10:90之間[13-15]．

本實(shí)驗(yàn)將流動(dòng)相A與B的比例設(shè)定為35:65和30:70．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的比例為35:65時(shí)，SV主成分峰的保留時(shí)間為21.603 min（圖1A），在0.2~3.2 μg/mL范圍內(nèi)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程為：=32666-2054（2=0.9996），線性關(guān)系良好．但在1.6 μg/mL和3.2 μg/mL處樣品主成分峰與周?chē)s峰沒(méi)有完全分開(kāi)（表1），不滿足藥典[16]關(guān)于分離度要大于1.5的要求．

而當(dāng)流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的比例為30:70時(shí)，SV主成分峰的保留時(shí)間為15.811 min（圖1B），在0.2~3.2 μg/mL范圍內(nèi)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程為：=33782-1424.5（2=0.9999），線性關(guān)系關(guān)系良好，所有濃度樣品主成分峰分離度良好（表1），滿足藥典[16]要求．

圖1 SV標(biāo)準(zhǔn)品主成分峰保留時(shí)間

進(jìn)一步對(duì)0.2、0.8和3.2 μg/mL 3個(gè)濃度SV溶液評(píng)價(jià)回收率測(cè)定結(jié)果顯示，該方法的平均回收率、日間及日內(nèi)精密度均較高（表2）．

表1 系列梯度濃度SV溶液HPLC法測(cè)定結(jié)果

表2 SV溶液平均回收率

此外，采用上述色譜條件對(duì)SVNs和SV進(jìn)行分析時(shí)，空白納米膠束溶液和空白溶液均未對(duì)樣品主成分峰造成干擾，說(shuō)明應(yīng)用上述HPLC法分析SV的專(zhuān)屬性良好（圖2）．因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC法檢測(cè)MG63細(xì)胞攝取入胞內(nèi)的SVNs中SV含量時(shí)，選擇流動(dòng)相A與B的比例為30:70，其他色譜條件不變．

2.2 MG63細(xì)胞對(duì)SVNs和SV的攝取對(duì)比

MG63細(xì)胞對(duì)SVNs和SV的攝取情況見(jiàn)圖3．結(jié)果顯示，在SVG中，MG63細(xì)胞對(duì)SV的攝入十分迅速，15 min時(shí)胞內(nèi)藥物濃度即達(dá)到最高峰．而MG63細(xì)胞對(duì)SVNs的攝入速度較慢，從30 min開(kāi)始，MG63對(duì)載藥膠束的攝入量才開(kāi)始逐漸增多．SVNs被成骨細(xì)胞攝取速度較慢的原因可能與其粒徑過(guò)小及表面未帶電荷有關(guān)系．已有研究顯示，載藥納米膠束的粒徑、表面所帶電荷情況等都可影響細(xì)胞對(duì)載藥納米膠束的攝?。袑W(xué)者[17]報(bào)道載藥納米膠束的粒徑在約50 nm時(shí)，其被細(xì)胞攝取的效率是最高的；而當(dāng)納米表面帶正電荷時(shí)，可增加載藥納米膠束與細(xì)胞膜的吸附能力，從而增加其被細(xì)胞攝取的效率[18]．在今后的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)控制SVNs的粒徑，并對(duì)其表面進(jìn)行修飾，可增加其被細(xì)胞攝取的效率，從而發(fā)揮出更強(qiáng)的促細(xì)胞成骨分化作用．

圖2 HPLC法測(cè)定SV的專(zhuān)屬性色譜圖

圖3 MG63細(xì)胞對(duì)SVNs與SV在不同時(shí)間點(diǎn)的攝取情況（n=6; *P<0.05; **P<0.01）

同時(shí)，SVG中的胞內(nèi)SV含量在達(dá)到高峰后隨即迅速下降，這種現(xiàn)象在多形核白細(xì)胞攝取亞胺培南[19]、人牙周膜成纖維細(xì)胞攝取甲硝唑和替硝唑[20]及紅細(xì)胞攝取抗癌鉑的配合物[21]等實(shí)驗(yàn)中均有出現(xiàn)．其可能的原因是，SV以被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入胞內(nèi)后容易被水解代謝，導(dǎo)致含量下降；也可能是藥物與細(xì)胞膜相互作用使膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致藥物漏出細(xì)胞外；此外，細(xì)胞膜上的外排蛋白是否也有參與，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證．

此外，在相同時(shí)間點(diǎn)，MG63細(xì)胞對(duì)SV和SVNs的攝取量除了在60 min時(shí)沒(méi)有顯著差異（＞0.05）外，在其他時(shí)間均存在顯著差異（＜0.05），其中，在加藥60 min后，MG63細(xì)胞對(duì)SVNs的攝取量顯著高于SV．由此可見(jiàn)，應(yīng)用納米膠束包載SV改變其劑型后，可顯著提高細(xì)胞內(nèi)SV的藥物濃度和存留時(shí)間，SVNs表現(xiàn)出較SV更強(qiáng)的成骨效能可能與此密切有關(guān)．

4 結(jié) 論

應(yīng)用HPLC法對(duì)MG63細(xì)胞攝取的SVNs中SV含量的直接定量檢測(cè)，并通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，加藥早期SVNs被細(xì)胞攝取的速度較SV慢，但SVNs可顯著提高SV在胞內(nèi)的濃度和作用時(shí)間，提示SVNs與SV被細(xì)胞攝取存在不同的方式，這可能是SVNs顯著提高SV促成骨效能的機(jī)制之一．

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Analysis the Uptake of Simvastatin-Loaded Nanomicelles in MG63 Cells by HPLC

NIU Mao1, FENG Xianling2, XU Youcheng1

（）

This experiment aims to quantitatively detect the uptake of simvastatin-loaded nanomicelles (SVNs) in human osteoblast-like cells (MG63 cells) by HPLC. First, the HPLC conditions for detecting simvastatin (SV) contained in SVNs were determined. And the specificity and accuracy of the method were evaluated. Secondly, the MG63 cells were incubated with SVNs and SV. The experiment was terminated at different times, and the cells were broken by frozen-thawed. The intracellular SV content were extracted and measured by using HPLC method. The results show that when the mobile phase ratio was 30:70 (V/V), the standard curve fitting equation for quantitative detection of SV contained in SVNs is=33782-1424.5 (2=0.9999), and the linear range was 0.2-3.2μg/mL. The specificity and accuracy of this HPLC method were higher, and the SV content in MG63 cells was successfully detected. At the same time, in the early stages of dosing, SVNs were taken up by MG63 cells more slowly than SV, but the intracellular drug content of SVNs was significantly higher than SV. There is a significant difference in the uptake of SVNs and SV by MG63 cells.

simvastatin; nanomicelles; high-performance liquid chromatography method; osteoblast; cellular uptake

2020-05-08

廣東省教育廳普通高校特色創(chuàng)新類(lèi)項(xiàng)目資助（2018GKTSCX028）、廣東省醫(yī)學(xué)基金資助項(xiàng)目（A2018170）

牛茂，男，山西人，博士，副教授，研究方向：納米藥物在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用．

R96

A

1672-0318（2020）05-0036-05