舒 璐 林佳艷 徐 源 曹 特 封吉猛 彭作剛

(1. 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢430072; 3. 上海交通大學(xué)云南(大理)研究院, 大理 671000)

魚類多樣性是水生生物多樣性的重要組成, 保護(hù)魚類多樣性有利于水生態(tài)系統(tǒng)的健康與穩(wěn)定。傳統(tǒng)的魚類多樣性監(jiān)測主要利用電捕、網(wǎng)捕與陷阱誘捕等方式采集漁獲物, 通過形態(tài)學(xué)鑒定和計(jì)數(shù)稱重, 識別魚類物種種類并統(tǒng)計(jì)魚類豐度與生物量[1,2]。然而這類方法普遍存在生態(tài)破壞性大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、形態(tài)鑒別困難和稀有物種捕獲率低等缺點(diǎn)。新興的環(huán)境DNA宏條形碼(Environmental DNA metabarcoding; eDNA metabarcoding)技術(shù)能夠通過直接提取環(huán)境樣品(如水、沉積物、土壤等)中DNA,運(yùn)用針對目標(biāo)類群的通用引物, 通過PCR擴(kuò)增結(jié)合高通量測序(High-throughput sequencing, HTS),對環(huán)境樣本中存在的多個(gè)目標(biāo)物種進(jìn)行識別[3]。整個(gè)過程無需采集目標(biāo)生物, 以非破壞性采樣、操作簡易高效和檢測靈敏度高的優(yōu)勢彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)監(jiān)測的不足, 對生物多樣性評估具有極大的應(yīng)用潛能[4]。

近年來, 環(huán)境DNA宏條形碼已被廣泛運(yùn)用于淡水和海洋生態(tài)系統(tǒng)的漁業(yè)管理與魚類多樣性監(jiān)測中[5]。Evans等[6]使用3對魚類通用引物從面積為0.022 km2的水庫中檢測出過去傳統(tǒng)方法監(jiān)測到的所有魚類物種, 另外還檢測到11種過去未捕獲過的魚類。Sigsgaard等[7]利用12S rRNA遺傳標(biāo)記成功監(jiān)測到丹麥沿海魚類群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化。盡管環(huán)境DNA宏條形碼的采樣方案與分析流程的各項(xiàng)環(huán)節(jié)在不同的研究中有不同的策略與優(yōu)化, 但成熟完整的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程也已形成, 保障了該技術(shù)在野外調(diào)查的成功應(yīng)用[8]。目前國內(nèi)運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼調(diào)查魚類多樣性的研究仍然不多[9—11]。環(huán)境DNA宏條形碼在國內(nèi)水生態(tài)系統(tǒng)的魚類多樣性監(jiān)測與保護(hù)領(lǐng)域還具有巨大的應(yīng)用空間。

洱海位于云南省大理白族自治州境內(nèi), 湖泊面積約252 km2, 是云南省第二大淡水湖泊, 具有豐富的魚類多樣性和較高的漁業(yè)利用價(jià)值[12]。洱海土著魚類歷史記錄有18種, 其中土著特有種8種[13]。20世紀(jì)60年代以來, 隨著過度捕撈、外來魚類引入和水體污染等人類活動干擾, 洱海魚類區(qū)系結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大變化, 土著魚類多樣性面臨嚴(yán)重危機(jī), 其中7種土著特有種成為瀕危物種[13,14]。洱海魚類多樣性與生態(tài)平衡問題受到國家和政府的密切關(guān)注,近年來當(dāng)?shù)卣畬Χ?shí)施生態(tài)魚種增殖放流, 通過土著魚類的投放恢復(fù), 期望改善洱海魚類區(qū)系組成, 保護(hù)魚類多樣性, 發(fā)展可持續(xù)的生態(tài)漁業(yè)[15]。

洱海魚類多樣性保護(hù)與生態(tài)恢復(fù)迫切需要建立快速有效和環(huán)境友好的監(jiān)測機(jī)制, 為漁業(yè)管理以及生態(tài)保護(hù)政策的制定與實(shí)施提供科學(xué)依據(jù)。本研究首次運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對洱海魚類多樣性進(jìn)行初步評估, 旨在探討環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在檢測洱海魚類多樣性上的可行性, 為洱海生物多樣性監(jiān)測以及水生生態(tài)保護(hù)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

本次采樣于2019年10月20日至22日進(jìn)行, 分別選取洱海(25°36′—25°58′N, 100°05′—100°17′E)沿岸12個(gè)采樣點(diǎn)和湖中線4個(gè)采樣點(diǎn), 各采樣點(diǎn)編號及GPS定位見圖 1。每個(gè)采樣點(diǎn)采集3個(gè)重復(fù)樣品,每個(gè)樣品使用容量為1000 mL的取水器采集表層水和底層水各1 L, 然后混合保存至已消毒的2 L廣口瓶中。16個(gè)采樣點(diǎn)共采集48個(gè)樣品。所有樣品均在24h內(nèi)使用0.45 μm的混合纖維素濾膜(MCE;Whatman公司)進(jìn)行真空抽濾。為評估是否存在外源DNA污染, 每次過濾設(shè)置1個(gè)陰性對照。在每份樣品過濾后, 濾膜立即冷凍保存, 并對濾膜接觸面進(jìn)行消毒和沖洗, 防止樣品間的交叉污染。冷凍濾膜置保溫箱保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

圖1 采樣點(diǎn)編號及GPS定位Fig. 1 Information of sampling locations

1.2 eDNA提取

使用PowerWater DNA Isolation Kits(Qiagen公司)按照試劑盒說明書提取濾膜DNA。每份樣品獨(dú)立提取, 并使用空白濾膜設(shè)置為陰性對照。所得eDNA溶液快速置于-20℃冷凍保存, 直至下一步PCR擴(kuò)增。

1.3 遺傳標(biāo)記擴(kuò)增與高通量測序

使用魚類通用引物MiFish-U[16]對eDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 該引物被用于擴(kuò)增線粒體12S rRNA基因的高變異區(qū)域, 擴(kuò)增長度約163—185 bp, 是魚類環(huán)境DNA宏條形碼分析的常用引物。20 μL PCR擴(kuò)增體系包括: 2—5 μL模板DNA(10 ng/μL)、正反向引物各0.8 μL (10 μmol/L)、2 μL dNTPs、4 μL 5 ×FastPfu緩沖液、0.4 μL FastPfu聚合酶和7—10 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95℃ 預(yù)變性5min; 27個(gè)循環(huán)包括: 95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s; 72℃最后延伸10min。每次PCR反應(yīng)使用ddH2O為模板作PCR陰性對照。

每份樣品重復(fù)擴(kuò)增三次, 將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后, 使用2%的瓊脂凝膠電泳檢測。所有陰性對照均無目的條帶, 表明從采樣、過濾、DNA提取至PCR擴(kuò)增均無外源魚類DNA污染。此外, 16個(gè)采樣點(diǎn)中只有9個(gè)采樣點(diǎn)的樣品獲得可檢測的PCR產(chǎn)物, 最后經(jīng)AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AXYGEN公司)純化后送至上海凌恩生物科技有限公司測序。每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物單獨(dú)建庫, 然后使用Illumina NovaSeq 6000測序平臺(Illumina 公司)進(jìn)行第二代高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各樣品的原始測序reads經(jīng)質(zhì)控、過濾、拼接和聚類后, 將得到的一致序列與本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行blastn比對(Identity>97%,e值<10-10), 全長擴(kuò)增區(qū)域以錯(cuò)配低于2個(gè)堿基匹配到唯一的物種序列。本地?cái)?shù)據(jù)庫包含了來自GenBank的32種魚類全線粒體基因組序列, 占洱海歷史記錄魚類種類的71.11%(洱海歷史報(bào)道魚類共45種[12—15,17,18])。各采樣點(diǎn)的重復(fù)樣品中未匹配到物種的序列被排除, 匹配到物種的序列數(shù)(Read counts)取平均值處理。9個(gè)采樣點(diǎn)檢測出的物種種類見表 1, 物種序列數(shù)見表 2。

另外, 為了比較兩種采樣方案(湖中線采樣與湖邊采樣)檢測出的物種種類及序列豐度是否存在差異, 本研究基于各采樣點(diǎn)的物種序列豐度, 使用R包的pheatmap函數(shù)繪制heatmap, 以展示物種eDNA在湖中線(Midline)與湖岸邊(Shoreline)的空間分布差異。為了進(jìn)一步探討不同采樣點(diǎn)的魚類群落組成異同, 本研究分別基于物種存在情況(Presence/absence)與物種序列豐度(Read counts)統(tǒng)計(jì)的Bray-Curtis相似性系數(shù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis, PCoA)。

2 結(jié)果

2.1 物種組成

在16個(gè)采樣點(diǎn)中, 有9個(gè)采樣點(diǎn)的樣品獲得可檢測的PCR產(chǎn)物, 包括洱海東岸的6個(gè)采樣點(diǎn)(S7—S12)和湖中線的3個(gè)采樣點(diǎn)(M1、M2和M4)。9個(gè)采樣點(diǎn)共檢測出魚類17種, 隸屬于4目5科13屬,其中土著種2科3屬5種; 外來種4科10屬12種(表 1)。9個(gè)采樣點(diǎn)共獲得已知物種序列2369773條, 各采樣點(diǎn)的物種序列數(shù)見表 2。圖 2展現(xiàn)出各采樣點(diǎn)的物種組成情況(物種種類和物種相對序列豐度)。盡管不同采樣點(diǎn)存在不同物種組成, 但仍有10種魚類在9個(gè)采樣點(diǎn)均被檢測到, 其中鯽(Carassius auratus)、鳙(Hypophthalmichthys nobilis)、麥穗魚(Pseudorasbora parva)、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)和食蚊魚(Gambusia affinis)在各采樣點(diǎn)均展現(xiàn)出相對較高的序列豐度。

2.2 物種空間分布

圖3顯示了魚類eDNA在湖中線與湖岸間沒有明顯的分布差異, 表明不同空間(湖中線與湖岸)采樣不會對檢測結(jié)果造成太大差異。此外, 泥鰍、鯽、鳙、麥穗魚和食蚊魚在9個(gè)采樣點(diǎn)的總序列豐度遠(yuǎn)高于其他物種, 表明這5種魚類為本次調(diào)查的優(yōu)勢種。

基于物種存在情況(圖 4a)和序列豐度(圖 4b)的PCoA分析分別揭示了不同采樣點(diǎn)間魚類組成情況的相似性?；谖锓N存在情況的PCoA分析(圖 4a)表明采樣點(diǎn)M2與S7具有完全一致的魚類組成, 采樣點(diǎn)S8具有與M2、S7相似的魚類多樣性。M1、M4與S9, S11與S12分別具有相似的魚類組成。S10具有不同于其他采樣點(diǎn)的魚類組成?；谛蛄胸S度的PCoA分析(圖 4b)表明采樣點(diǎn)S8、S10、S11、S12和M2具有相似的魚類組成, 采樣點(diǎn)S7、M1和M4具有相似的魚類組成, 而S9具有與其他采樣點(diǎn)相比不同的魚類組成。

表1 基于環(huán)境DNA宏條形碼在洱海9個(gè)采樣點(diǎn)檢測到的魚類物種Tab. 1 List of fish species detected by eDNA metabarcoding at each of 9 sampling sites in Erhai Lake

3 討論

3.1 基于環(huán)境DNA的洱海魚類多樣性檢測

本研究首次使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)分析了洱海魚類多樣性, 共檢測出17種魚類, 其中以鯉科魚類居多, 總計(jì)13種, 占魚類物種總數(shù)的76.47%;而鯽、鳙、泥鰍、麥穗魚和食蚊魚為優(yōu)勢種。雖然本研究檢測出的魚類種數(shù)不如傳統(tǒng)漁獲物方法監(jiān)測的多(表 3), 但檢測出的魚類組成與過去傳統(tǒng)方法監(jiān)測的結(jié)果一致, 均表明洱海魚類以鯉科魚類居多, 經(jīng)濟(jì)型魚類和小型魚類為當(dāng)前優(yōu)勢種。此外,本研究檢測出了已報(bào)道的大部分外來種(12種), 說明洱海外來種豐度高于土著種。盡管低豐度的土著種DNA較難被采集到, 但通過增加采樣點(diǎn)和采樣次數(shù), 可以提高對瀕危物種的檢測率[8]。

表2 洱海中9個(gè)采樣點(diǎn)的物種序列數(shù)Tab. 2 The number of reads detected for each species at each of 9 sampling sites in Erhai Lake

圖2 各采樣點(diǎn)的魚類物種組成Fig. 2 The composition of fish species at each sampling site

3.2 洱海魚類空間分布的初步探討

除高體鳑鲏(Rhodeus ocellatus)、中華鳑鲏(Rhodeus sinensis)、波氏吻虎魚(Rhinogobius cliffordpopei)這類棲息于淺水的小型魚類僅在湖岸水樣中被檢測到, 其他魚類在湖中線和湖岸水樣中均被檢測到, 且魚類序列豐度沒有明顯的湖內(nèi)、湖岸空間差異(圖 3)。然而, 9個(gè)采樣點(diǎn)無論是在物種種類水平還是在序列豐度水平上均揭示了魚類空間分布的細(xì)微差異(圖 4)。本研究由于缺少洱海西岸的檢測結(jié)果, 只基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)無法展現(xiàn)出完整的魚類群落空間分布格局。費(fèi)驥慧等[12]基于傳統(tǒng)監(jiān)測結(jié)果顯示洱海魚類群落在空間分布上具有明顯差異, 可劃分為洱海西岸與南北端湖濱帶群落類型和東岸與湖心區(qū)群落類型。因此, 通過成功獲取洱海東、西岸及湖心的eDNA樣本, 將有助于分析洱海魚類群落空間分布格局?？傊? 本研究的結(jié)果表明只采集岸邊水樣已足夠用于湖泊魚類的多樣性(Species richness)評估, 但廣泛的空間采樣能夠揭示更細(xì)致的魚類分布模式和群落結(jié)構(gòu), 這與Zhang等[9]的研究結(jié)果一致。

圖3 湖中線和湖岸樣品的魚類相對序列豐度Fig. 3 Relative sequence abundances of fish detected in the samples from midline and shoreline

圖4 基于物種存在情況(a)和序列豐度(b)統(tǒng)計(jì)的魚類組成相似性Fig. 4 PCoA of the similarity in fish composition based on species occurrence (a) and read counts (b) across sampling sites

3.3 影響環(huán)境DNA檢測的環(huán)境因素

魚類DNA在水體中具有復(fù)雜的存在機(jī)制, 其產(chǎn)生、降解及移動過程受諸多環(huán)境因素(如紫外線、水溫、pH、水體流動、水域底質(zhì)等)的影響[19]。本次調(diào)查共采集洱海16個(gè)采樣點(diǎn), 其中只有9個(gè)采樣點(diǎn)獲得可檢測的PCR產(chǎn)物, 另外7個(gè)采樣點(diǎn)(S1—S6和M3)的樣品沒有擴(kuò)增出目的條帶或PCR產(chǎn)物濃度過低不符合測序要求。本研究認(rèn)為一些環(huán)境因素的影響可能導(dǎo)致了魚類eDNA在東、西兩岸的檢測差異。首先, 西岸采樣點(diǎn)大多位于蒼山十八溪入湖河口附近[20], 近岸水域的eDNA分子受入湖溪流自西向東的流向影響, 可能向湖心擴(kuò)散。其次, 洱海秋季主導(dǎo)西南風(fēng)向, 魚類eDNA分子很可能向東岸聚集。再者, 東、西兩岸近岸的水域底質(zhì)存在差異, 東岸底質(zhì)以礫石為主, 西岸底質(zhì)以水草居多, 底質(zhì)不同可能導(dǎo)致兩岸邊eDNA濃度存在差異[21]。以上原因可能導(dǎo)致西岸水樣采集的魚類eDNA濃度低于東岸水樣, 從而影響了西岸魚類eDNA的獲取與擴(kuò)增。此外, 已有研究表明水體中的DNA極不穩(wěn)定, 容易降解[22], 因此水樣采集后應(yīng)盡快過濾, 用濾膜冷凍保存。本研究中西岸水樣從采集到預(yù)處理的過程比東岸水樣花費(fèi)了更長的時(shí)間, 導(dǎo)致水體eDNA的降解量增加, 這可能也是西岸水樣沒有獲得可檢測的PCR產(chǎn)物的原因之一。

3.4 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的優(yōu)勢與不足

相比傳統(tǒng)魚類監(jiān)測方法, 環(huán)境DNA宏條形碼在魚類多樣性評估及生態(tài)保護(hù)方面具有明顯的優(yōu)勢,主要體現(xiàn)在: (1)非破壞性采樣。少量的水樣采集不會傷害瀕危魚類和破壞當(dāng)?shù)厣鷳B(tài), 并且不受禁漁期和禁漁區(qū)的限制, 可以隨時(shí)監(jiān)測目標(biāo)區(qū)域的魚類多樣性; (2)便捷高效, 節(jié)約成本。環(huán)境DNA宏條形碼使用1—2 L水樣便可實(shí)現(xiàn)多個(gè)分類單元的快速鑒定, 無需花費(fèi)船只租賃或購買漁獲物的費(fèi)用, 無需依賴形態(tài)學(xué)和分類學(xué)的專業(yè)知識, 同時(shí)節(jié)省了調(diào)查作業(yè)和物種鑒定所需的時(shí)間。Evans等[23]通過比較電捕法與eDNA方法監(jiān)測溪鱒(Salvelinus fontinalis)在Wisconsin 水域分布時(shí)所需的費(fèi)用與采樣工作量,發(fā)現(xiàn)相比電捕法, eDNA方法節(jié)省了67%的開支, 且只需較少的采樣量; (3)檢測靈敏度高。已有研究[24—27]表明使用環(huán)境DNA宏條形碼檢測魚類多樣性的結(jié)果要優(yōu)于傳統(tǒng)監(jiān)測方法, 尤其對于傳統(tǒng)方法很難捕捉到的稀有物種或隱蔽物種, 使用eDNA技術(shù)更容易檢測到。

表3 基于傳統(tǒng)方法監(jiān)測到的洱海魚類資源狀況Tab. 3 Fish species composition detected by conventional monitoring methods in different years

盡管環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)存在上述優(yōu)勢, 但它無法完全替代傳統(tǒng)的魚類調(diào)查方法[28]。首先, 環(huán)境DNA宏條形碼只能憑借環(huán)境樣品中的遺傳信息來判斷物種的存在情況, 無法獲取目標(biāo)物種的種群數(shù)量、年齡結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)和生長發(fā)育階段等相關(guān)信息。其次, 環(huán)境DNA宏條形碼分析依賴分子數(shù)據(jù)庫的完整性, 當(dāng)數(shù)據(jù)庫缺少目標(biāo)物種序列時(shí)則會導(dǎo)致假陰性檢測[29]。此外, 由于水體環(huán)境中eDNA存在機(jī)制的復(fù)雜性[19], 通過eDNA序列豐度評估物種相對生物量的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步的研究[30]。

4 結(jié)論

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)具有非破壞性采樣、便捷高效以及檢測靈敏度高的優(yōu)勢, 在魚類多樣性的監(jiān)測與保護(hù)工作中具有巨大的應(yīng)用前景。本研究首次使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)評估了洱海魚類多樣性, 證明了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)檢測洱海魚類物種組成和魚類分布情況的可行性。盡管環(huán)境DNA宏條形碼無法完全替代傳統(tǒng)的魚類調(diào)查方法, 但可以作為一種重要的補(bǔ)充工具, 用于快速反映洱海魚類多樣性和魚類空間分布, 減少傳統(tǒng)監(jiān)測對洱海生態(tài)系統(tǒng)的干擾, 縮短調(diào)查周期, 提高檢測效率, 為洱海水生生態(tài)保護(hù)的迅速應(yīng)答提供可靠數(shù)據(jù)。

致謝:

感謝袁昌波博士在水樣采集工作中提供的幫助; 感謝陶曄、查富蓉在生物信息學(xué)分析工作中提供的幫助。