王能漢 鄧巧玲 范垚城 唐海濱 雷 磊 曹 宏

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

長江作為我國第一大河, 在我國社會發(fā)展中有重要的地位。然而, 近20年來其干線及支流的污水排放總量明顯增加, 雖經(jīng)一定程度的治理及控制,但其流域內(nèi)的河流及湖泊水質(zhì)改善程度依然效果不顯著[1]。最新的中國環(huán)保公報中顯示: 長江流域的淡水資源中Ⅳ類水占9.0%, Ⅴ類水占1.8%, 劣Ⅴ類水占1.8%[2], 這幾類水是無法飲用且不能與人體直接接觸的, 特別是劣Ⅴ類水質(zhì)除調(diào)節(jié)局部氣候外,幾乎無其他功能[3]。長江岸線在城市化和工業(yè)化以及農(nóng)業(yè)村鎮(zhèn)的道路建設(shè)過程中, 對水環(huán)境均造成了不同程度的影響。其污染面源類型涉及生活污水、工業(yè)污水、農(nóng)業(yè)面源污水、漁業(yè)污水、長江航道等。為了對這幾種水質(zhì)綜合評價, 除常規(guī)理化指標(biāo)外, 對污染河流進(jìn)行生物毒性檢測和分析尤為必要。

稀有鯽(Gobiocypris rarus)是一種我國特有的小型鯉科魚類,亦是優(yōu)良的模式動物[4]。從1990年起, 稀有鯽就被作為我國標(biāo)準(zhǔn)魚類實驗動物而進(jìn)行了目的培育, 目前該物種已有較多應(yīng)用于遺傳學(xué)、基礎(chǔ)生物學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域的研究報道[5]。同時, 稀有鯽已被我國環(huán)境保護(hù)部列為新化學(xué)物質(zhì)測試推薦魚種[6,7], 首個關(guān)于使用稀有鯽的測試標(biāo)準(zhǔn)—化學(xué)品稀有鯽急性毒性試驗(GB/T29763—2013)目前也已經(jīng)正式公布并實施[8]。本研究以稀有鯽胚胎為試驗對象, 參考國際經(jīng)濟與合作組織(Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)在2013 年頒布的《魚類胚胎急性毒性試驗方法》(OECD TG 236,Fish Embryo Acute Toxicity Test, FET)[9], 檢測長江岸線宜昌江段五種不同污染類型的典型水樣對稀有鯽胚胎的毒性效應(yīng), 探討其水質(zhì)毒性檢測的有效方法, 并為長江岸線宜昌江段水體污染的綜合評價及后續(xù)治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水樣采集及水質(zhì)分析

結(jié)合污水監(jiān)測點布設(shè)的原則[10], 共在宜昌江段設(shè)計5個采樣點, 5個采樣點水樣包含長江城鎮(zhèn)開發(fā)過程的幾種典型代表水樣: 市政管網(wǎng)生活污水、工業(yè)污水、農(nóng)業(yè)面源污水、漁業(yè)污水和長江航道水樣。采樣時間是2019年3月26—27日, 根據(jù)采樣點編號為1#、2#、3#、4#、5#水樣。取得的水樣用棕色玻璃瓶密封后帶回, 并放入4℃冷庫保存以供取用,具體取樣地點如圖 1所示, 各組水樣詳細(xì)信息見表 1。

試驗水樣的化學(xué)需氧量(Chemical oxygen demand, COD)、總氮(TN)、總磷(TP)、硝態(tài)氮(NO3-N)、氨氮(NH3-N)、亞硝態(tài)氮(NO2-N)和高錳酸鹽指數(shù)分別通過重鉻酸鹽反應(yīng)法、硫酸鹽氧化法、消解-抗壞血酸法、鎘反應(yīng)法、水楊酸法和重氮化法、酸性高錳酸鹽法完成。重金屬采樣微波消解法測定。農(nóng)藥殘留則采用UPLC超高效液相色譜法測定。

圖1 水體采樣點流域示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the sampling sites

表1 水體采樣點的地理信息Tab. 1 The geographic information of the sampling sites

1.2 稀有鯽胚胎的急性毒性試驗

健康的稀有鯽實驗親魚來自于中國科學(xué)院水生生物研究所稀有鯽普通級和清潔級資源保存基地培育的野生封閉群(IHB)系。每天投喂2次紅蟲, 光照12h。實驗開始前期, 根據(jù)其產(chǎn)卵間隔節(jié)律和產(chǎn)前行為, 將親魚配對, 并人工授精。人工授精90min內(nèi), 體視鏡(OLYMPUS BX53)鏡檢選擇處于16細(xì)胞期前, 無明顯不規(guī)則分裂或破損的受精卵用于急性毒性實驗。

試驗方法參考《魚類胚胎急性毒性試驗方法》(OECD TG 236)。用滴管隨機挑選24 枚受精魚卵,轉(zhuǎn)移到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NEST), 每孔1個受精卵。其中第一排4個孔各加入2 mL空白對照組水樣作為對照組, 空白對照組水樣采用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水, 配置方法如下: a. 氯化鈣溶液: 將11.76 g CaCl2·2H2O溶解于超純水中, 稀釋至1 L; b. 硫酸鎂溶液: 將4.93 g MgSO4·7H2O溶解于超純水中, 稀釋至1 L; c. 碳酸氫鈉溶液: 將2.59 g NaHCO3溶解于超純水中, 稀釋至1 L; d. 氯化鉀溶液: 將0.23 g KCl溶解于超純水中, 稀釋至1 L。將以上四種溶液各25 mL加以混合并用超純水稀釋至1 L[11]。

其余每一排4孔則分別加入不同的5組待檢水樣, 每孔2 mL, 每個24孔細(xì)胞板作為1組, 每孔各放置1枚魚卵, 共設(shè)3組平行。然后將孔板置于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱中(珠江LRH-250-G)、光照比為12h﹕12h (白晝﹕黑夜) 的環(huán)境中暴露, 每24h 換1 次試驗用水, 進(jìn)行為期96h的暴露試驗。在試驗的24h、48h、72h和96h時檢查胚胎的發(fā)育情況和存活率。采用體式顯微鏡觀察測試胚胎發(fā)育情況, 每24h記錄死亡胚胎數(shù)量、幼魚孵出數(shù)量及畸形幼魚數(shù)量, 并統(tǒng)計48h時胚胎心率。利用數(shù)碼相機連接體式顯微鏡(Carl Zeiss Stemi 508)對胚胎的損傷特征和幼魚的畸形特征進(jìn)行拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示, 使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA), 組間比較采用Duncan’s多重比較進(jìn)行檢驗。以P<0.05為顯著性差異。

暴露實驗中主要的統(tǒng)計指標(biāo)計算公式如下: 心率(次/分鐘)=15s心率×4; 孵化率(%)=(孵化個體/受精卵數(shù))×100; 畸形率(%)=(畸形個體數(shù)/受精卵數(shù))×100; 存活率(%)=(存活數(shù)/受精卵數(shù))×100。

2 結(jié)果

2.1 水樣的理化指標(biāo)

我們對水樣進(jìn)行了常規(guī)污染物的檢測, 表 2顯示了五組水樣的常規(guī)污染物檢測結(jié)果。同時, 我們將部分指標(biāo)與Ⅲ類地表水指標(biāo)進(jìn)行了比較, 發(fā)現(xiàn):1#水樣各項基本達(dá)到Ⅲ類地表水指標(biāo); 2#水樣總磷超標(biāo)外, 其他各項指標(biāo)均達(dá)到Ⅲ類地表水指標(biāo);3#和4#水樣各項指標(biāo)全面超標(biāo), 水質(zhì)較差; 5#水樣在總磷和高錳酸鹽指數(shù)存在一定程度的超標(biāo)(圖 2)。同時, 我們還檢測了各組水樣中的重金屬含量(表 3),發(fā)現(xiàn)3#水樣中各項重金屬指標(biāo)均高于其他組。

表2 各水樣的常規(guī)污染物信息Tab. 2 The concentration of several conventional pollutants in each sample (mg/L)

圖2 各水樣的常規(guī)污染物指標(biāo)與Ⅲ類地表水的對比Fig. 2 The conventional pollutants index among the level III standard surface water in each sample

2.2 生物毒性

本實驗在暴露處理48h后, 統(tǒng)計了各組稀有鯽胚胎的心率(圖 3)。4#水樣胚胎心率最低,3#水樣其次, 二者相對于對照組均有極顯著的降低(P<0.01)。

同時, 我們在72h后, 統(tǒng)計了各組水樣處理后的稀有鯽胚胎孵化率(圖 4)。2#水樣胚胎孵化率變化趨勢總體上與對照組最為接近, 受到影響最小。1#、5#水樣胚胎的整體孵化率一定程度低于對照組, 而3#、4#水樣胚胎整體上孵化率顯著低于其他組(P<0.05)。

研究發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過猇亭工業(yè)污水長江排污口的3#水樣和取自猇亭生活污水管網(wǎng)的4#水樣處理后的稀有鯽胚胎, 在其發(fā)育過程中出現(xiàn)了多種畸形癥狀, 例如脊椎彎曲、身體彎曲、卵黃囊水腫、卵黃囊吸收遲緩及魚鰾無法充氣等; 此外, 4#水樣處理后的稀有鯽胚胎相比較其他組, 還出現(xiàn)了多例心包腫大的畸形(圖 5)。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn), 4#水樣處理后的稀有鯽胚胎出現(xiàn)畸形率及發(fā)育遲緩的比例最高, 3#次之; 而相比較而言, 經(jīng)過1#、2#、5#水樣處理后的胚胎則幾乎無畸形癥狀出現(xiàn)(圖 6)。

在進(jìn)行完96h暴露實驗后, 統(tǒng)計最終各組的成活率(圖 7)。結(jié)果顯示3#、4#水樣處理后的稀有鯽胚胎成活率最低, 而2#水樣處理后與對照組均無死亡現(xiàn)象, 1#、5#組處理后的稀有鯽胚胎成活率則略低于對照組。本次實驗結(jié)果顯示2#水樣其生物毒性相對最少, 對稀有鯽胚胎發(fā)育幾乎無影響, 1#、5#其次, 3#工業(yè)污水水樣水質(zhì)較差, 4#生活污水水樣污染最嚴(yán)重, 對胚胎發(fā)育毒性最大。

3 討論

表3 各水樣中的重金屬質(zhì)量濃度Tab. 3 The heavy metal concentrations of each sample (μg/L)

圖3 各水樣對稀有鯽胚胎心率的影響Fig. 3 The effect of samples on the heart rate of the embryo of rare minnow

圖4 各水樣處理后的稀有鯽胚胎孵化率對比Fig. 4 The hatching rates of the embryo of rare minnow in different sample treated groups

圖5 發(fā)育異常的稀有鯽胚胎特征Fig. 5 The characteristics of malformation in the embryos of rare minnow

本次實驗采集了長江岸線宜昌段城鎮(zhèn)化過程中五種不同類型的典型水樣。其中, 生活污水取自宜昌市猇亭區(qū)的生活污水市政管網(wǎng), 其來源主要是家庭生活使用后產(chǎn)生的廢水,此類廢水中通常含有大量的氨鹽和磷酸鹽[12]。工業(yè)污水是取自宜昌市猇亭化工園區(qū)長江排污口, 該園區(qū)主要有宜昌市興發(fā)化工集團(tuán)等企業(yè), 主要集中于磷化工系列產(chǎn)品的生產(chǎn)與開發(fā)。農(nóng)業(yè)面源污染的水樣及漁業(yè)污水分別取自于枝江市安福寺鎮(zhèn)的瑪瑙河及宜昌市夷陵區(qū)的黃柏河, 這類水體的污染主要來自農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中的氮素和磷素等營養(yǎng)物質(zhì)、農(nóng)藥以及其他有機或無機污染物質(zhì)。包括化肥污染、農(nóng)藥污染、集約化養(yǎng)殖場污染。主要污染物是重金屬、硝酸鹽、氨鹽、有機磷、六六六、DDT、病毒、病原微生物、寄生蟲和塑料增塑劑等[13]。此外, 我們還采集了長江宜昌白洋港江段的水樣, 這五組水樣能較為全面的反映在該季節(jié)長江岸線宜昌江段各類型水體的總體污染狀況。

本研究針對五組水樣檢測了常規(guī)污染物及部分重金屬含量等指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn), 多種污染物共存時往往存在疊加、拮抗或協(xié)同等復(fù)合毒性作用[14]。此外, 單一的理化指標(biāo)不能反映多種污染物之間的聯(lián)合作用, 運用生物對水體生物毒性進(jìn)行評估直接反映復(fù)雜體系中所有組分的綜合作用[15]。本研究利用五組水樣處理了稀有鯽胚胎, 結(jié)果顯示長江宜昌白洋港江段、農(nóng)業(yè)面源及漁業(yè)區(qū)域水樣水質(zhì)相對較好, 而取自猇亭化工園區(qū)長江排污口的3#水樣和猇亭區(qū)生活污水市政管網(wǎng)的生活污水(4#水樣)則水質(zhì)污染相對嚴(yán)重。

圖6 各水樣中稀有鯽胚胎畸形率及發(fā)育遲緩率的對比Fig. 6 The effects of samples on malformation and retardation rates of embryos of rare minnow

圖7 各水樣處理96h后的稀有鯽胚胎存活率對比Fig. 7 The survival rates of the embryos of rare minnow in different water sample treated (96h) groups

已有的研究表明, 稀有鯽胚胎在25℃環(huán)境下在發(fā)育到約34h時, 進(jìn)入心臟搏動期, 心臟完全形成并開始緩緩搏動[16]。此次我們利用不同水樣處理后發(fā)現(xiàn), 48h時的心率結(jié)果顯示4#水樣處理后的胚胎心率最低, 3#水樣次之, 顯示出發(fā)育異常的特征。研究發(fā)現(xiàn), 4#水樣的氨氮指標(biāo)相對最高, 處理后的稀有鯽胚胎出現(xiàn)了大量的發(fā)育異常并且死亡率明顯增高。特別是4#水樣處理的稀有鯽胚胎出現(xiàn)了大量的心包腫大現(xiàn)象, 心率、畸形率和存活率等影響指標(biāo)上也更加嚴(yán)重, 說明4#水樣中的高氨氮含量在對稀有鯽胚胎發(fā)育的生物毒性上起了主要作用。此外, 4#水樣處理后的胚胎存在提前破膜現(xiàn)象, 推測有可能是氨氮通過滲透卵膜, 改變胚胎細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓造成的[17,18]。

綜合本次試驗所有結(jié)果, 我們發(fā)現(xiàn)2#(長江宜昌白洋港江段)水樣水質(zhì)最好, 污染相對最少, 對稀有鯽胚胎發(fā)育幾乎無影響; 1#(黃柏河, 漁業(yè)污水)水樣和5#(瑪瑙河, 農(nóng)村面源污染)水樣水質(zhì)相對較好; 3#水樣(猇亭化工園區(qū)工業(yè)污水)及4#水樣(猇亭區(qū)生活污水)的水質(zhì)最差, 特別是4#水樣, 其對稀有鯽胚胎發(fā)育毒性最大。因此, 對長江岸線宜昌江段水污染治理提出的建議是: 該區(qū)域生活污水污染治理應(yīng)放在第一位, 其次工業(yè)污水污染。尤其需要優(yōu)先控制的指標(biāo)是生活污水中的氨氮含量。