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        原鈣黏蛋白10通過NF-κB/cyclin D1信號通路抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖*

        2020-10-15 05:15:14岳麗玲于海濤劉立琨高秀麗朱文斌
        中國病理生理雜志 2020年9期
        關(guān)鍵詞:乳腺癌檢測

        岳麗玲, 劉 溪, 張 微, 于海濤, 劉立琨, 高秀麗, 朱文斌, 李 娜

        (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)藥科學(xué)研究院,2附屬第三醫(yī)院乳腺外科,黑龍江齊齊哈爾161006)

        我國乳腺癌發(fā)病率位居女性腫瘤發(fā)病率榜首,且發(fā)病呈逐年上升和年輕化趨勢[1]。雖然乳腺癌的診治目前已取得長足的進展,但其高發(fā)病率及治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍嚴(yán)重威脅著患者的生存。因此,深入研究乳腺癌的發(fā)病機制,探尋新的腫瘤分子標(biāo)志物成為研究的重點。

        原鈣黏蛋白10(protocadherin 10,PCDH10)是鈣黏蛋白家族的新成員,早期有關(guān)PCDH10的研究主要集中于神經(jīng)元疾病,如自閉癥[2]。最近的研究表明,PCDH10經(jīng)常因其啟動子區(qū)高甲基化而失活,并在胃癌、大腸癌和肺癌以及其他腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用[3-6]。此外,過度表達PCDH10能夠抑制包括鼻咽癌、食道癌和結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞生長[7]。然而,關(guān)于乳腺癌中PCDH10表達的研究非常有限,僅有報道PCDH10在乳腺癌中發(fā)生異常甲基化[8-9],但是PCDH10在乳腺癌細胞中的表達、生物學(xué)功能和機制仍未闡明。因此,本研究通過檢測乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞MCF-10A中PCDH10的表達情況,體外建立PCDH10穩(wěn)定過表達細胞,并分析PCDH10對乳腺癌細胞增殖和細胞周期的影響及分子機制,以探討PCDH10在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用途徑。

        材料和方法

        1 細胞株

        人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-1和Bcap37及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A均購自中科院上海細胞庫。

        2 主要試劑

        L-15培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清(HyClone);MEBM培養(yǎng)液(LONZA);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);PCR試劑盒(TaKaRa);兔抗人PCDH10多克隆抗體(Proteintech);兔抗人細胞周期蛋白D1(cyclin D1)單克隆抗體、細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)單克隆抗體、磷酸化核因子κB(nucear factor-κB,NF-κB)p65 亞 基(phosphorylated p65,p-p65)單克隆抗體和磷酸化NF-κB抑制蛋白α(phosphorylated NF-κB inhibitor α,p-IκBα)單克隆抗體(CST);鼠抗人GAPDH單克隆抗體(CST);MTT粉劑(Sigma);細胞周期檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);PCDH10慢病毒過表達載體由本實驗室構(gòu)建;PCDH10引物序列由上海生工生物工程公司合成。

        3 實驗方法

        3.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液,ZR-75-1和Bcap37細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液,MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于L-15培養(yǎng)液,MCF-10A細胞培養(yǎng)于MEBM培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中均含有10%的胎牛血清;除MDA-MB-231細胞不需CO2外,所有細胞均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長。

        3.2 RT-PCR檢測PCDH10在乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中的表達 采用Trizol法分別提取各細胞總RNA,取500 ng總RNA進行RT-PCR擴增。PCDH10的上游引物序列為5'-ACTGCTATCAGGTATGCCTG-3',下游引物序列為5'-GTCTGTCAACTAGATAGCTG-3',擴增產(chǎn)物長度為219 bp;內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3',下游引物序列為5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3',擴增產(chǎn)物長度為303 bp。PCR條件:94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35次循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

        3.3 RT-PCR及Western blot法驗證MDA-MB-231細胞慢病毒感染效果 胰酶消化MDA-MB-231細胞,在24孔板每孔中加入5×104個細胞,細胞80%以上融合時進行病毒感染。以預(yù)實驗得到的重組慢病毒載體pLV-PCDH10的最佳MOI值100感染MDA-MB-231細胞,8 h后更換細胞上清為新鮮培養(yǎng)液,加入2 mg/L的嘌呤霉素篩選1周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCDH10的MDA-MB-231細胞,命名為pLV-PCDH10細胞;同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染的空白對照(blank)組和轉(zhuǎn)染病毒空載體的陰性對照(pLV-NC)組細胞。分別提取各組細胞總RNA與總蛋白,RT-PCR和Western blot法分別檢測PCDH10在各組細胞中的mRNA和蛋白表達。

        3.4 MTT法分析細胞增殖能力 取處于對數(shù)生長期的pLV-NC組和pLV-PCDH10組細胞,分別以每孔3×103個細胞接種于96孔板,每組設(shè)4個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后加入20μL的MTT溶液(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄上清,每孔加入150μL的DMSO,避光震蕩10 min后酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度(A)值,繪制細胞生長曲線圖。

        3.5 平板集落形成實驗 收集pLV-NC及pLVPCDH10組細胞,計數(shù),按每孔1.5×103個細胞接種于6孔板中,每組細胞設(shè)3個復(fù)孔。37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2周,甲醇固定15 min,PBS洗去固定液,加入0.2%結(jié)晶紫染色20 min,流水緩慢沖去染液,室溫干燥。計數(shù)集落數(shù),并按以下公式計算集落形成率:集落形成率(%)=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

        3.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將轉(zhuǎn)染細胞按每孔5×105個接種于6孔板中,37℃培養(yǎng)過夜。收集各組細胞,預(yù)冷PBS洗1次,加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌2次,然后加入100μL的RNase A 37℃水浴30 min,再加入400μL PI染液,重懸細胞,4℃避光反應(yīng)30 min,流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化。

        3.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 收集pLV-NC組和pLV-PCDH10組細胞提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。每組取20μg蛋白進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜,封閉液室溫封閉2 h后加入I抗[PCDH10(1∶800)、cyclin D1(1∶1 000)、CDK4(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)]4℃孵育過夜。TBST洗膜后,加入II抗室溫孵育2 h,TBST洗膜后ECL顯色,凝膠成像分析系統(tǒng)成像。以GAPDH作為內(nèi)參照,檢測各蛋白條帶吸光強度。

        4 統(tǒng)計學(xué)處理

        各組實驗重復(fù)3次,所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA),以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 乳腺癌細胞中PCDH10基因的表達

        RT-PCR結(jié)果顯示,PCDH10基因在MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-1和Bcap37這4種乳腺癌細胞中的表達水平均低于正常乳腺上皮細胞MCF-10A,且在MDA-MB-231和Bcap37細胞中表達水平最低(P<0.01),見圖1。

        2 慢病毒感染MDA-MB-231細胞后PCHD10的mRNA和蛋白表達上調(diào)

        感染pLV-PCDH10慢病毒載體的MDA-MB-231細胞經(jīng)嘌呤霉素篩選后,RT-PCR和Western blot法驗證效果。結(jié)果顯示,pLV-PCDH10組細胞PCDH10的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于blank組及pLV-NC組(P<0.05),而PCDH10在blank組及pLVNC組中的mRNA和蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05),見圖2。后續(xù)實驗選取同樣感染慢病毒的pLV-NC組作為pLV-PCDH10組的陰性對照。

        Figure 1.The expression of PCDH10 mRNA in breast cancer cell lines and normal mammary epithelial MCF-10A cells detected by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs MCF-10A cells.圖1 乳腺癌細胞與正常人乳腺上皮MCF-10A細胞中PCDH10的mRNA表達水平

        3 過表達PCDH10可抑制MDA-MB-231細胞增殖

        MTT結(jié)果顯示,pLV-NC組細胞生長旺盛,而接種48 h后穩(wěn)轉(zhuǎn)pLV-PCDH10組細胞活力顯著低于pLV-NC組(P<0.05),見圖3A;集落形成實驗結(jié)果顯示,pLV-PCDH10組細胞集落形成率(12.27%)遠低于pLV-NC組(31.87%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3B。

        4 過表達PCDH10影響MDA-MB-231細胞周期分布

        流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,pLV-PCHD10組細胞G0/G1期細胞比例(57.46%)高于pLV-NC組(47.04%),差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義(P<0.05);與 pLV-NC 組(30.01%)相比,pLV-PCHD10組S期細胞比例(23.90%)顯著降低(P<0.05),見圖4。

        5 過表達PCDH10對MDA-MB-231細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

        通過Western blot檢測周期相關(guān)蛋白cyclin D1和CDK4的表達,結(jié)果顯示,與pLV-NC組相比,pLVPCHD10組細胞cyclin D1和CDK4蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05),見圖5。

        Figure 2.PCDH10 expression was signifcantly increased in MDA-MB-231 cells transfected with pLV-PCDH10.A:the mRNA expression of PCDH10 was detected by RT-PCR;B:the protein expression of PCDH10 was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group or pLV-NC group.圖2 轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞中PCDH10的mRNA和蛋白表達水平

        Figure 3.Overexpression of PCDH10 inhibited the proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells in vitro.A:the cell viability was measured by MTT assay;B:the growth of the cells was detected by colony formation assay.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pLV-NC group.圖3PCDH10過表達對MDA-MB-231細胞增殖的影響

        6 過表達PCDH10對NF-κB和IκBα蛋白表達的影響

        利用Wetern blot檢測過表達PCDH10細胞中磷酸化NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達變化。結(jié)果顯示,與pLV-NC組相比,pLV-PCDH10組中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著降低(P<0.01),見圖6。

        討 論

        Figure 4.PCDH10 overexpression induced MDA-MB-231 cell cycle arrest at G1phase.The distribution of cell cycle was analyzed by fl ow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pLV-NC group.圖4 PCDH10過表達對MDA-MB-231細胞周期的影響

        Figure 5.PCDH10 overexpression suppressed the expression of cell cycle-related proteins cyclin D1 and CDK4.The protein expression levels of cyclin D1 and CDK4 were examined by Western blot.GAPDH was used as an internal loading control.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pLV-NC group.圖5 過表達PCDH10對cyclin D1及CDK4蛋白表達的影響

        PCDH10基因位于人類染色體4q28.3,屬于原鈣黏連蛋白家族的成員,在細胞間的信息傳遞、細胞黏附和分化等方面發(fā)揮重要作用;還在神經(jīng)細胞中參與軸突引導(dǎo),影響神經(jīng)元活性,維持神經(jīng)回路穩(wěn)定及細胞形成的功能[10-11]。最近的研究認為,PCDH10是一種新型的腫瘤抑制基因,在肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、宮頸癌等多種實體腫瘤中表現(xiàn)出表觀遺傳學(xué)沉默作用[12],并與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-14]。PCDH10的表達和甲基化狀態(tài)異常還與肝癌[15]、胰腺癌[16]患者預(yù)后相關(guān),PCDH10表達的下調(diào)預(yù)示著預(yù)后不良。這些研究表明PCDH10在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Liu等[9]報道乳腺癌患者PCDH10發(fā)生異常甲基化,而PCDH10在乳腺癌細胞中具體發(fā)揮的生物學(xué)作用及其相關(guān)分子機制尚不清楚。

        Figure 6.PCDH10 overexpression suppressed the phosphorylation of NF-κB p65 and IκBα in MDA-MB-231 cells.The phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα were detected by Western blot.GAPDH was used as an internal loading control.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs pLV-NC group.圖6 過表達PCDH10對MDA-MB-231細胞NF-κB和IκBα蛋白的影響

        本研究通過RT-PCR檢測顯示,MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-1和Bcap37這4種乳腺癌細胞中PCDH10的mRNA表達水平均低于正常乳腺上皮MCF-10A細胞,提示PCDH10在乳腺癌細胞中存在表達下調(diào)或者缺失。我們將PCDH10慢病毒過表達載體成功轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細胞進一步研究PCDH10對乳腺癌細胞功能的影響。細胞增殖能力的分析顯示,PCDH10過表達可抑制細胞生長,降低細胞增殖能力,提示PCDH10可能參與乳腺癌細胞增殖的調(diào)控。Ying等[7]證實PCDH10過表達可以減少非小細胞肺癌H1650和H1975細胞的增殖和遷移;在肝癌細胞中,PCDH10的上調(diào)抑制HepG2和HuH7細胞增殖及集落形成[17]。我們的結(jié)果與這些研究結(jié)果相一致,表明PCDH10能夠影響腫瘤細胞的增殖。

        真核細胞通過調(diào)控細胞周期維持機體的正常代謝和增殖,細胞周期調(diào)控紊亂使腫瘤細胞異常增殖是腫瘤的基本特征[18]。因此,我們進一步檢測了PCDH10過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞周期的影響,結(jié)果表明PCDH10過表達可引起G0/G1期細胞周期阻滯,使進入S期的細胞比例減少,從而抑制細胞增殖。細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1能夠在G1期達到表達峰值,是細胞周期啟動因子,可與CDK4/6結(jié)合,介導(dǎo)G1到S期的轉(zhuǎn)換,當(dāng)我們評估PCDH10過表達后cyclin D1和CDK4表達水平時,發(fā)現(xiàn)二者的蛋白表達量均減少。這表明PCDH10可通過阻滯細胞周期而抑制乳腺癌細胞增殖。

        NF-κB是一個存在于真核細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子,在人類多種惡性腫瘤均觀察到NF-κB p65活化,并在腫瘤細胞的增殖分化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[19]。有研究報道,PCDH10通過抑制NF-κB途徑誘導(dǎo)骨髓瘤細胞凋亡[20]。我們觀察到在MDAMB-231細胞中過表達PCDH10可使NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平下調(diào)。IκB是NF-κB的主要調(diào)控抑制蛋白,其磷酸化使NF-κB激活,啟動下游基因轉(zhuǎn)錄[21],這表明PCDH10能夠抑制NF-κB的活性。Hinz等[22]研究表明cyclin D1為NF-κB下游靶基因,其啟動子上存在NF-κB結(jié)合的位點,當(dāng)NF-κB表達激活過程被阻滯后,cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄表達受抑制,導(dǎo)致細胞周期延遲[23]。因此,我們的結(jié)果表明,PCDH10可通過抑制NF-κB p65和IκB的磷酸化阻斷NF-κB激活,從而下調(diào)cyclin D1等細胞周期相關(guān)蛋白表達,使細胞周期調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致乳腺癌細胞的生長增殖受到抑制。

        綜上所述,PCDH10基因能夠抑制乳腺癌細胞的增殖,其作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB/cyclin D1信號通路途徑,影響細胞周期而發(fā)揮抑癌功能。

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