張 玲， 高迎真， 卞 琳， 殷文娟， 張燕燕， 劉 靜

（1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，山西太原030001）

乳腺癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一。我國乳腺癌的發(fā)病率雖低于歐美國家，但死亡率卻明顯高于歐美國家，且我國是全球乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一［1］。臨床上根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）及Ki-67表達(dá)情況可將乳腺癌分為Luminal A/B、HER2陽性和三陰性乳腺癌4類分子亞型，其中Luminal A/B型通常對內(nèi)分泌治療敏感，HER2陽性型亦可以采用HER2靶向治療，而三陰性乳腺癌由于缺乏特異性的治療靶點(diǎn)以及預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)，往往預(yù)后最差。

選擇性剪接在真核生物體內(nèi)普遍存在，受核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）以及各類蛋白質(zhì)組成的剪接體的控制。編碼剪接體相關(guān)因子的基因發(fā)生突變或基因表達(dá)水平的改變可以引起剪接位點(diǎn)的錯(cuò)誤識別、內(nèi)含子保留及外顯子丟失等，從而影響參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、血管生成及轉(zhuǎn)移等過程的重要基因的轉(zhuǎn)錄及加工。許多腫瘤細(xì)胞中存在正常細(xì)胞中不存在的選擇性剪接事件，靶向剪接調(diào)控因子可能代表一種新的癌癥治療途徑。高通量的全基因組測序技術(shù)已經(jīng)揭示了多種腫瘤類型中均存在剪接因子的顯著突變［2-5］。Lawrence等［6］通過對 892例乳腺癌患者的癌組織及配對正常組織的全外顯子測序泛組學(xué)分析，鑒定出剪接因子3B亞基1（splicing factor 3B subunit 1，SF3B1）基因在乳腺癌（尤其是ER陽性乳腺癌）中存在顯著突變（主要集中于K700E及Q534P的突變熱點(diǎn)上），該基因可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的驅(qū)動(dòng)基因。SF3B1與乳腺癌的研究目前主要集中在ER陽性乳腺癌，而SF3B1在突變頻率較低、預(yù)后更差、靶向藥物更少的三陰性乳腺癌中的作用尚不清楚。本研究擬檢測SF3B1敲減對人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，從而為三陰性乳腺癌治療靶點(diǎn)的選擇提供一定的參考資料。

材料和方法

1 材料

MDA-MB-231細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫。兔抗人SF3B1單克隆抗體（Abcam）；鼠抗人GAPDH單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；高糖DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（HyClone）；MTT（Sigma）；二甲基亞砜（Sigma）；RNA提取試劑及PCR試劑盒（TaKaRa）；annexin V-APC（eBioscience）；Matrigel（BD Bioscience）；Transwell小室（Corning）。引物由上海生工生物工程有限公司合成；LV-SF3B1-RNAi慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞在含有10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)更換培養(yǎng)液，融合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 SF3B1基因的敲減 將LV-SF3B1-RNAi慢病毒以一定的MOI值加入融合度達(dá)30%～40%的MDAMB-231細(xì)胞中，感染16 h后更換培養(yǎng)液，72 h后檢測敲減效率。敲減序列為5'-CCGGGAGCACAGACCTCCAAAGATTCTCGAGAATCTTTGGAGGTCTGTGCCTTTTTG-3'（SF3B1-shRNA-1）和 5'-CCGGTGCAACTGAACTTGAAGATGACTCAGTCATCTTCAAGTTCAGTTGCATTTTTG-3'（SF3B1-shRNA-2）。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為3組：對照（control，Ctrl）組（轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組）、sh-1組（轉(zhuǎn)染SF3B1-shRNA-1）和sh-2組（轉(zhuǎn)染SF3B1-shRNA-2）。收集3組細(xì)胞沉淀，用裂解液冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，并用BCA法測蛋白濃度。將相同質(zhì)量的不同組別的蛋白變性后上樣，用SDS-PAGE分離各組蛋白質(zhì)，電泳后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。再將膜用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，然后在4℃下過夜孵育Ⅰ抗（1∶200），室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶1 000）1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

2.4 RNA提取及qPCR 收集各組細(xì)胞沉淀，加入Trizol和氯仿后震蕩離心，吸取上清至新EP管，加入等體積的異丙醇，震蕩，-20℃靜置30～60 min；離心后棄去上清，加入75%乙醇洗沉淀；干燥，加入DEPC水溶解。使用SYBR-Green PCR Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（反應(yīng)體系20μL），再以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。SF3B1的上游引物序列為5'-GAGAAATTCAAGGCAAGAAGG-3'，下游引物序列為5'-GACCAAGCAAACTCGTAGATG-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物序列為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。所有反應(yīng)均重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞活力檢測 實(shí)驗(yàn)分組同前。3組細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種到96孔板中，每孔培養(yǎng)液的最終體積是200μL，并在正常條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)24、48、72、96和120 h后，每孔加入20μL MTT（5 g/L），將96孔板置于培養(yǎng)箱正常孵育4 h，然后小心吸出培養(yǎng)液并加入200μL二甲基亞砜，搖床上孵育15～30 min后，用酶標(biāo)儀檢測每孔A值（波長490 nm）。

2.6 集落形成計(jì)數(shù) 各組細(xì)胞以每孔800～1 000個(gè)接種在含有2 mL培養(yǎng)液的6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。14～20 d后，PBS清洗，用4%多聚甲醛固定15 min，1%結(jié)晶紫染色20 min，然后用活水慢慢沖洗樣品，計(jì)數(shù)有效集落（≥50個(gè)細(xì)胞）。

2.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 提前4 h將Matrigel與基礎(chǔ)培養(yǎng)液按照1∶6稀釋，混勻后在Transwell小室上層加入100 μL，在Transwell小室的上室每孔內(nèi)加5×104個(gè)細(xì)胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)液終體積為200μL，下室內(nèi)加入600μL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，48 h后用4%多聚甲醛固定20 min，1%結(jié)晶紫染色20 min，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)操作大致相同，前者不需要加入Matrigel。

2.8 細(xì)胞凋亡測定 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞后，胰酶消化收細(xì)胞沉淀，4℃預(yù)冷的D-Hanks清洗后用1×緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀，離心收集細(xì)胞沉淀后用200μL 1×緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。加入10μL annexin VAPC染色，室溫避光10～15 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率的變化。

2.9 RNA測序 RNA測序在上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。提取細(xì)胞總RNA，使用Oligo（dT）標(biāo)記的磁珠富集真核生物mRNA，以提取的mRNA隨機(jī)片段作為模板，利用隨機(jī)引物合成cDNA，然后再合成雙鏈cDNA；用AMPure XP珠子純化產(chǎn)物，用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶修復(fù)DNA的粘性末端，在3'末端添加堿基A并連接接頭；最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得最終測序文庫。測序文庫質(zhì)檢合格后，用HiSeq 4000測序儀（Illumina）進(jìn)行測序，讀取的長度為2×150 bp（PE150）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SF3B1基因敲減對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

通過RT-qPCR和Western blot檢測MDA-MB-231細(xì)胞系中SF3B1敲減效率，結(jié)果表明SF3B1敲減效率達(dá)70%以上，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，見圖1。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在96 h，sh-1、sh-2和Ctrl組的A值分別為0.417±0.003、0.389±0.002和0.577±0.009；在120 h，sh-1、sh-2和 Ctrl組的 A值分別為 0.482±0.006、0.472±0.005 和 0.791±0.005；統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在96 h和120 h，SF3B1敲減組的A值與陰性對照組相比均顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Figure 1.Knockdown efficiency of SF3B1-shRNA for SF3B1 gene in MDA-MB-231 cells was detected by qPCR（A）and Western blot（B）.Mean±SD.n=3.圖1 MDA-MB-231細(xì)胞中SF3B1-shRNA對SF3B1基因的敲減效率

Figure 2 The effect of SF3B1 knockdown on the viability of MDA-MB-231 cells detected by MTT assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Ctrl group.圖2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測SF3B1敲減對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

2 SF3B1基因敲減對MDA-MB-231細(xì)胞集落形成能力的影響

細(xì)胞鋪板15 d后，SF3B1敲減組MDA-MB-231細(xì)胞的集落形成數(shù)為30.7±2.1和27.7±2.0，而陰性對照組的集落形成數(shù)為79.3±0.6；與陰性對照組相比，SF3B1敲減組MDA-MB-231細(xì)胞集落形成能力顯著降低（P＜0.01），見圖3。

3 SF3B1基因敲減對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，SF3B1敲減組的凋亡率為（22.9±0.8）%和（24.9±0.9）%，而陰性對照組的凋亡率為（1.4±0.2）%；與陰性對照組相比，SF3B1敲減組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P＜0.01），見圖4

4 SF3B1基因敲減對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Figure 3.The effect of SF3B1 knockdown on the colony formation ability of MDA-MB-231 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Ctrl group.圖3SF3B1敲減對MDA-MB-231細(xì)胞集落形成能力的影響

基于Transwell小室的細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SF3B1敲減組的侵襲細(xì)胞數(shù)為23.2±0.2和32.0±1.2，而陰性對照組的侵襲細(xì)胞數(shù)為170.0±12.5；與陰性對照組相比，SF3B1敲減組細(xì)胞的侵襲能力顯著降低（P＜0.01），見圖5。此外，SF3B1敲減組的遷移細(xì)胞數(shù)為3.0±0.3和2.1±0.2，而陰性對照組的遷移細(xì)胞數(shù)為（110.0±1.4）；SF3B1敲減組細(xì)胞的遷移能力較陰性對照組顯著降低（P＜0.01），見圖6。

Figure 4 The effect of SF3B1 knockdown on the apoptosis of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Ctrl group.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測SF3B1敲減對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

5 SF3B1敲減對其下游通路的影響

分別對sh-1組和陰性對照組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)），平均每個(gè)樣品獲得5.2×107個(gè)配對末端的150 bp的測序讀數(shù)。圖7顯示了差異表達(dá)基因的整體分布情況。差異表達(dá)分析使用2倍變化的顯著差異閾值。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，SF3B1敲減組中有860個(gè)基因顯著上調(diào)，776個(gè)基因顯著下調(diào)。圖8顯示了前100個(gè)差異表達(dá)基因，并根據(jù)表達(dá)變化對3個(gè)重復(fù)序列進(jìn)行聚類分析。與對照組相比，SF3B1敲減組顯著下調(diào)的基因包括PLA2G4B、INO80B-WBP1、TNFSF10、RASSF4等，顯著上調(diào)的基因包括TMEM33、MAGEA2B、LDLRAD4、LSMEM1等。

Figure 5.The effect of SF3B1 knockdown on the invasion ability of MDA-MB-231 cells detected by Transwell invasion assay.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Ctrl group.圖5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測SF3B1敲減對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 6.The effect of SF3B1 knockdown on the migration ability of MDA-MB-231 cells detected by Transwell migration assay.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Ctrl group.圖6 Transwell遷移襲實(shí)驗(yàn)檢測SF3B1敲減對MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力的影響

Figure 7.The volcano mapping of the differentially expressed genes.圖7 差異基因表達(dá)水平火山圖分析

基于差異基因的KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因顯著富集在以下信號通路：RAS信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、緊密連接、MAPK信號通路及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等（P＜0.05），見圖9。

討 論

異常剪切及剪切因子編碼基因的變異是腫瘤相關(guān)的重要表型之一，腫瘤的發(fā)生發(fā)展經(jīng)常伴隨異常的RNA剪接［7］。例如，Bcl基因的異常剪接可形成不同形式的轉(zhuǎn)錄本，長鏈的轉(zhuǎn)錄本Bcl-x具有抑制凋亡的作用，在各類癌癥細(xì)胞中表達(dá)增高，而短鏈Bcl-x（s）形式則可以促進(jìn)凋亡［8］。剪接因子編碼基因的突變，可能通過異常的剪切事件，造成下游某些癌基因的激活或者腫瘤抑制基因的失活，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SF3B1基因在多種癌癥中的顯著突變提示其可能通過異常剪接在癌癥中發(fā)揮作用［9］。

SF3B1基因定位于染色體2q33.1，其編碼蛋白是剪接體催化核心——U2小細(xì)胞核核糖核蛋白體（U2-small nuclear ribonucleoprotein，U2-snRNP）的重要組分，U2-snRNP復(fù)合體由SF3A、SF3B及12S RNA亞基組成，SF3B1作為SF3B復(fù)合物的一個(gè)亞單位，可以與RNA前體的5'及3'端分枝點(diǎn)交聯(lián)，在前mRNA內(nèi)含子的精確剪切及mRNA成熟過程中發(fā)揮重要作用［10］。新一代基因組測序技術(shù)揭示了多種癌癥中存在SF3B1基因的顯著突變，包括乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、葡萄膜黑色素瘤等［2-5］。Lawrence等［6］對892例乳腺癌患者的癌組織及配對正常組織進(jìn)行全外顯子測序泛組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SF3B1在乳腺癌中存在顯著突變（ER陽性者居多），突變類型多為集中在K700E及Q534P等突變熱點(diǎn)的錯(cuò)義突變。但SF3B1在突變率較低的三陰性乳腺癌中的作用尚不清楚。

Figure 8.Cluster analysis of the differentially expressed genes.圖8 差異基因表達(dá)水平聚類分析

本研究結(jié)果顯示，在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中SF3B1的敲減，顯著抑制了細(xì)胞的增殖、集落形成、侵襲和遷移，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，提示SF3B1在乳腺癌中可能發(fā)揮癌基因的作用，這與著名的“20/20法則”相符，即若某個(gè)基因的突變以錯(cuò)義突變?yōu)橹?，且?0%的突變是重復(fù)出現(xiàn)的位點(diǎn)，則該基因可能是以激活突變?yōu)橹鞯陌┗颍?1］。與此一致的是，有研究表明，相比配對正常組織，SF3B1在乳腺癌組織中過表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，且SF3B1基因突變患者相比未突變者預(yù)后更差［12-13］。Zhang等［14］的研究亦表明，在宮頸癌中抑制SF3B1可通過上調(diào)剪接相關(guān)的Tap73/ΔNp73誘導(dǎo)G2/M期阻滯，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。SF3B1活性的抑制還可以降低前列腺癌細(xì)胞的侵襲性（增殖、遷移和凋亡）功能參數(shù)，調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)態(tài)。這些研究提示SF3B1可能在包括乳腺癌在內(nèi)的各種癌癥中發(fā)揮重要的癌基因的作用［15］。

Figure 9.Enrichment analysis of KEGG signaling pathway of the differentially expressed genes.圖9 差異基因的KEGG信號通路富集分析

SF3B1與包括乳腺癌在內(nèi)的各種癌癥關(guān)系密切，但其在乳腺癌中的具體作用機(jī)制尚不清楚。Neelamraju等［16］的研究表明，SF3B1的缺失可降低MCF7乳腺癌細(xì)胞（ER陽性）的干細(xì)胞特征，而在MDA-MB-231細(xì)胞（三陰性）中，SF3B1的缺失對干細(xì)胞特性沒有影響。該研究結(jié)果提示，本研究中SF3B1對MDA-MB-231細(xì)胞促癌作用的影響可能與干細(xì)胞特性無關(guān)，可能存在其它作用機(jī)制。Maguire等［2］的研究應(yīng)用RNA測序鑒定了SF3B1突變的乳腺癌樣本中的差異剪接事件，包括蛋白編碼基因TMEM14C、RPL31、DYNL11、UQCC和ABCC5，以及長鏈非編碼RNA基因CRNDE等，提示SF3B1可能通過影響以上基因的剪切方式在乳腺癌中發(fā)揮作用。而受SF3B1影響的差異表達(dá)基因及信號通路未見報(bào)道。本研究對SF3B1基因敲減前后的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了一組差異表達(dá)基因，還對差異表達(dá)基因進(jìn)行了相關(guān)的信號通路富集分析，包括RAS信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、MAPK信號通路及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等，提示SF3B1可能通過以上通路影響三陰性乳腺癌的生物學(xué)行為，其中RAS與MAPK信號通路的激活在多種惡性腫瘤組織均有大量文獻(xiàn)報(bào)告。RAS信號通路的持續(xù)激活，可使正常細(xì)胞獲得惡性轉(zhuǎn)化的能力，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖［17］；MAPK信號通路的過度表達(dá)及激活，一方面放大來自外界生長因子的信號，另一方面通過細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)作用于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，引起生長、增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡等過程相關(guān)的基因表達(dá)，從而在癌癥發(fā)生及演進(jìn)過程中起促進(jìn)作用［18］。另外，本研究還鑒定到甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝為SF3B1下游靶信號通路。SF3B1可誘導(dǎo)細(xì)胞對絲氨酸缺乏的敏感性，這與參與L-絲氨酸早期合成的磷酸甘油酸脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）的下調(diào)有關(guān)［19］。值得注意的是，三陰性乳腺癌細(xì)胞嚴(yán)重依賴絲氨酸合成，部分三陰性乳腺癌患者存在PHGDH基因的顯著擴(kuò)增［20-21］。三陰性乳腺癌中SF3B1突變頻率低于ER陽性乳腺癌是否與絲氨酸合成途徑受抑制有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。另外，在De La Garza等［22］的研究中，TGF-β和p53信號通路相關(guān)基因在SF3B1缺失時(shí)顯著上調(diào)，但這兩個(gè)通路的P值在本研究中顯示高于0.05，可能由于物種及細(xì)胞不同，SF3B1作用的方式與通路不盡相同。

綜上所述，MDA-MB-231細(xì)胞中SF3B1基因敲減可能通過RAS信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、MAPK信號通路及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲和遷移。