余麗麗 ， 林曉青 ， 章良銘 ， 吳慶偉 ， 張松高 ， 陳敦雁 ， 潘小杰 ， 黃 毅 ，4△

（1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，2福建省立醫(yī)院檢驗科，3福建省立醫(yī)院胸外科，4福建省立醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實驗研究中心，福建福州350001）

肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率和致死率高居首位的惡性腫瘤，嚴重危害人類健康［1-2］。作為一種具侵襲性的腫瘤，肺癌細胞呈現(xiàn)高度惡性的生物學(xué)行為，患者病情進展迅速，早期發(fā)現(xiàn)與及時的手術(shù)根治性切除對患者的預(yù)后意義重大［3-4］，但由于肺癌早期多無特異臨床癥狀，大多數(shù)患者在臨床就診時已為中晚期，而喪失了手術(shù)治療的最佳時機，導(dǎo)致患者的5年生存率不足15%［5］。作為肺癌手術(shù)切除之外的重要治療手段與方法，放療、化療及分子靶向治療近年來取得了較大的發(fā)展，但總體治療效果仍不能令人滿意，因此，尋找肺癌相關(guān)新的分子靶點，對于提高肺癌患者生存率、改善預(yù)后具有重要的意義。

轉(zhuǎn)錄中介因子1γ（transcriptional intermediary factor 1γ，TIF1γ）又 名 TRIM33、ECTO、PTC7 或RFG7，是一種TGF-β/Smad通路的調(diào)控因子，可通過泛素化降解Smad4或與磷酸化的Smad2/Smad3競爭性結(jié)合Smad4，抑制Smad4調(diào)節(jié)的TGF-β信號通路［6-7］。已有文獻報道，TIF1γ在胚胎發(fā)育［8-9］、轉(zhuǎn)錄延伸［10］、DNA修復(fù)［11］、細胞分化［10-12］等過程中發(fā)揮重要的作用。TIF1γ與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但在不同腫瘤中的表現(xiàn)具復(fù)雜性，可能以抑癌［7，13-14］或致癌［15-16］因子的作用方式參與腫瘤進展。我們的前期研究表明，TIF1γ在肺癌組織存在異常高表達，而配對癌旁組織均為陰性或低表達［17］，提示TIF1γ可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展進程，但其發(fā)揮何種作用方式有待闡明。為此，本研究擬通過構(gòu)建TIF1γ過表達慢病毒與siRNA，分別轉(zhuǎn)染相對低表達與高表達TIF1γ的肺癌細胞，從TIF1γ過表達/敲減兩個層面，在體外深入研究TIF1γ表達對肺癌細胞活力、凋亡、遷移與侵襲的影響，探討其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用。

材料與方法

1 細胞培養(yǎng)

人肺癌細胞株H460、H226、H1299、SK-MES-1及A549（上海中科院細胞所）和包裝慢病毒所用的293FT細胞株（福州世宸生物科技有限公司）分別用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次。實驗用細胞為狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞。

2 主要試劑

慢病毒包裝所需的pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G輔助質(zhì)粒，包含目的基因的質(zhì)粒及空載體（可表達綠色熒光蛋白）均購自福州世宸生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液、opti-MEM無血清培養(yǎng)液和PBS均購自HyClone；FBS和0.25%胰蛋白酶購自Gibco；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和Polybrene購自Sigma；總RNA抽提試劑NucleoZOL購自MACHEREY-NAGEL；反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒購自Promega；UltraSYBR一步法熒光定量PCR試劑盒（Low ROX）購自北京康為世紀生物科技有限公司；牛血清白蛋白購自生工生物工程（上海）股份有限公司；TIF1γ抗體購自Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京康為世紀有限公司；SuperSingal West Femto試劑購自Thermo Fisher Scientific；Lipofectamine 3000購自Invitrogen；DEPC水、蛋白裂解液、CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫染液和4%多聚甲醛購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒、嘌呤霉素和DNA含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；凋亡試劑盒PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I購自BD，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Matrigel和Transwell小室購自Corning。

3 實驗方法

3.1 RT-qPCR法檢測肺癌細胞中TIF1γ mRNA表達 按照NucleoZOL試劑說明書提取不同肺癌細胞總RNA并測定濃度和純度，分別取1μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR Green I為熒光染料在RT-qPCR儀上進行擴增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸1 min，共40個循環(huán)；熔解曲線分析95℃30 s。以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果用2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=CtTIF1γ-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.2TIF1γ過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建 用Lipofectamine 3000將含目的基因的質(zhì)粒與3種慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞，收集培養(yǎng)48和72 h后的富含慢病毒顆粒的上清液，離心后用0.4μm濾器過濾，-80℃保存?zhèn)溆?。A549細胞培養(yǎng)至細胞融合度達50%～70%，加入1 mL目的基因病毒上清液或空載體病毒液，以及終濃度為10 mg/L的Polybrene，6 h后加2 mL完全培養(yǎng)液，次日換液，隨后用5 mg/L嘌呤霉素持續(xù)篩選，直到獲得穩(wěn)定表達TIF1γ的A549細胞株。通過RT-qPCR及Western blot法檢測Lenti-TIF1γ組與Lenti-Ctrl組TIF1γ表達情況，驗證TIF1γ過表達的效果。

3.3TIF1γ敲減細胞的構(gòu)建TIF1γ特異性siRNA（si-TIF1γ）及陰性對照si-Ctrl由福州尚亞生物技術(shù)公司設(shè)計并合成，序列如下：si-TIF1γ序列為5'-ACAAGUAUAUGCACAGAAATT-3'；si-Ctrl序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。H460 細胞培養(yǎng)至融合度達30%～50%，轉(zhuǎn)染前1 h更換為無雙抗培養(yǎng)液，通過Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染si-TIF1γ及si-Ctrl，培養(yǎng)6 h后換液。48 h后檢測si-TIF1γ組與si-Ctrl組TIF1γ表達并進行細胞實驗。

3.4 Western blot法檢測肺癌細胞的TIF1γ蛋白表達 加入細胞裂解液提取實驗組與對照組細胞總蛋白，BCA法測定其濃度后取等量蛋白99℃變性10 min；取30μg總蛋白，經(jīng)8%SDS-PAGE分離蛋白后，100 V 110 min電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉2 h；TBST洗膜3次，加入1∶1 000稀釋的TIF1γ抗體4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，加入SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate工作液，置于化學(xué)發(fā)光成像儀（上海培清科技有限公司）內(nèi)成像拍照。

3.5 CCK-8法檢測細胞活力 收集處于對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度為2.0×107/L，以每孔2.0×103個接種于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)Lenti-TIF1γ組、Lenti-Ctrl組、si-TIF1γ組和si-Ctrl組細胞，24、48和72 h后加入CCK-8，2 h后檢測A450的值，繪制生長曲線。

3.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡與細胞周期 （1）Lenti-TIF1γ組和Lenti-Ctrl組細胞凋亡檢測：收集對數(shù)生長期各組細胞1×105個，預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，離心，加入100 μL 1× Binding Buffer重懸；加入5μL PE-Annexin V和5μL 7-AAD，避光、室溫孵育10 min；加入400 μL 1× Binding Buffer，輕輕混勻，染色后樣品在1 h內(nèi)用Accuri C6 Plus流式細胞儀（BD）檢測。（2）si-TIF1γ組和si-Ctrl組細胞凋亡檢測：細胞染色試劑為5μL Annexin V-FITC和5μL PI Staining Solution，其余步驟與（1）相同。（3）細胞周期檢測：收集實驗組與對照組細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，取1 mL單細胞懸液；70%乙醇4℃固定2 h，PBS洗滌2次后，細胞沉淀中加100μL RNase A溶液，重懸細胞，37℃水浴30 min；加入400μL PI染色液混勻，4℃避光孵育30 min；在Accuri C6 Plus流式細胞儀上對樣本細胞進行檢測，用ModFit LT 5.0軟件分析細胞周期不同階段的細胞比例。

3.7 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲能力 （1）細胞遷移實驗參考鄭佳瑩等［18］的實驗步驟，具體如下：收集對數(shù)生長期的細胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×108/L，在小室下層加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基，上層加入100μL無血清培養(yǎng)基重懸的細胞；培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗，再用0.1%結(jié)晶紫對遷移細胞染色20 min；PBS清洗后使用棉簽輕輕擦去上層細胞，室溫晾干后，隨機選取5個視野（×200）觀察和計數(shù)遷移細胞。（2）細胞侵襲實驗在細胞懸液加入小室前，向小室中加入1∶9稀釋的Matrigel，凝固后加入細胞懸液，其余操作與細胞遷移實驗相同。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均重復(fù)3次。應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0和GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析和圖表制作。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間差異比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TIF1γ過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株及敲減細胞株的構(gòu)建

1.1 高/低表達TIF1γ肺癌細胞株的篩選 采用RT-qPCR檢測H460、H226、H1299、SK-MES-1及A549這5種肺癌細胞內(nèi)TIF1γ mRNA表達水平，結(jié)果顯示，TIF1γ在H460細胞中相對高表達，在A549細胞中相對低表達（圖1）。因此，我們在后續(xù)實驗中通過慢病毒使A549細胞中的TIF1γ過表達，而通過siRNA敲減H460細胞中的TIF1γ。

Figure 1.Comparison of relative expression levels of TIF1γ mRNA in 5 lung cancer cell lines.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs H226 cells.圖1 5種肺癌細胞株中TIF1γ mRNA相對表達量的比較

1.2TIF1γ過表達與敲減效果驗證 RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與Lenti-Ctrl組相比，Lenti-TIF1γ組A549細胞TIF1γ的mRNA與蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），見圖2A；而與si-Ctrl組相比，si-TIF1γ組H460細胞TIF1γ的mRNA與蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖2B。

Figure 2.The expression levels of TIF1γ in lung cancer cells were detected by RT-qPCR and Western blot.A：the relative mRNA and protein expression levels of TIF1γ in Lenti-TIF1γ and Lenti-Ctrl groups；B：the relative mRNA and protein expression levels of TIF1γ in si-TIF1γ and si-Ctrl groups.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Lenti-Ctrl group；##P＜0.01 vs si-Ctrl group.圖2 RT-qPCR和Western blot檢測TIF1γ在各組肺癌細胞中的表達

2 TIF1γ對肺癌細胞活力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與Lenti-Ctrl組相比，TIF1γ過表達的Lenti-TIF1γ組A549細胞活力顯著降低（P＜0.01），見圖3A；而與si-Ctrl組相比，TIF1γ敲減的si-TIF1γ組H460細胞活力顯著增強（P＜0.01），見圖3B。

3 TIF1γ對肺癌細胞凋亡和周期的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與相應(yīng)的陰性對照組相比，TIF1γ過表達與敲減的肺癌細胞凋亡率均無顯著改變（圖4）；與Lenti-Ctrl組相比，Lenti-TIF1γ組A549細胞的G0/G1期比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低（P＜0.01），見圖5A；而與si-Ctrl組相比，si-TIF1γ組H460細胞的G0/G1期比例顯著降低，S期細胞比例顯著升高（P＜0.01），見圖5B。

4 TIF1γ對肺癌細胞遷移與侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與Lenti-Ctrl組相比，Lenti-TIF1γ組A549細胞穿過小室的細胞數(shù)目和穿過Matrigel至下室的細胞數(shù)目均顯著減少（P＜0.01），見圖6A；而與si-Ctrl組相比，si-TIF1γ組H460細胞穿過小室的細胞數(shù)目和穿過Matrigel至下室的細胞數(shù)目均顯著增多（P＜0.01），見圖6B。

Figure 3.The effects of TIF1γ on the viability of A549（A）and H460（B）cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Lenti-Ctrl group；##P＜0.01vs si-Ctrl group.圖3 TIF1γ對肺癌A549和H460細胞活力的影響

Figure 4.The effects of TIF1γ on the apoptosis of A549 and H460 cells.圖4 TIF1γ對肺癌A549和H460細胞凋亡的影響

討 論

Figure 5.The effects of TIF1γ on the cell cycle of A549（A）and H460（B）cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Lenti-Ctrl group；##P＜0.01 vs si-Ctrl group.圖5 TIF1γ對肺癌A549和H460細胞周期的影響

近年來TIF1γ與腫瘤的相關(guān)性引起關(guān)注，研究表明TIF1γ在一些腫瘤中存在異常表達，但其表現(xiàn)具復(fù)雜性，且相關(guān)文獻報道不一。Ding等［19］的研究表明TIF1γ在肝癌組織的表達水平顯著降低，且是切除術(shù)后復(fù)發(fā)和生存獨立而重要的危險因素；有趣的是，TIF1γ在肝癌細胞中起著雙重作用，它有利于早期肝癌的腫瘤生長，但不促進晚期肝癌的腫瘤生長；此外，TIF1γ顯著抑制早期和晚期肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。TIF1γ的低表達亦見于胰腺癌組織［6，20］。Ligr等［6］報道良性胰腺細胞系呈現(xiàn)TIF1γ低表達、Smad4高表達，而惡性胰腺細胞系則與之相反；進一步研究表明TIF1γ過表達導(dǎo)致Smad4水平降低，沉默則抑制腫瘤侵襲，只要改變（過表達或沉默）TIF1γ的表達均會抑制良性和惡性胰腺細胞的增殖，并阻滯細胞周期于G2期，提示TIF1γ可能是胰腺癌治療的一個潛在靶點。小鼠胰腺癌模型顯示TIF1γ對腫瘤具抑制作用，且不依賴Smad4途徑［20］。相比在肝癌和胰腺癌組織的低表達，TIF1γ在腸癌和乳腺癌組織則表現(xiàn)為異常高表達。Jain等［21］的研究表明，在Ⅰ和Ⅱ期腸癌組織TIF1γ蛋白的表達顯著上調(diào)，且與患者的病程進展相關(guān)；此外，TIF1γ的表達減弱了TGF-β誘導(dǎo)的生長抑制［9］。Kassem等［22］對248例乳腺癌組織的免疫組化檢測結(jié)果顯示，核TIF1γ和細胞質(zhì)TGF-β 1的陽性染色率高達35.9%和30.4%，且TIF1γ和TGFβ1的高表達與患者的遠端轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不良預(yù)后密切相關(guān)。但另一項研究則表明，相比正常乳腺組織，TIF1γ在人乳腺癌組織中的表達略有降低，乳腺癌中FOXM1的過表達可與Smad3/Smad4相互作用并抑制TIF1γ與Smad4的結(jié)合，從而減弱TIF1γ對TGF-β信號傳導(dǎo)的抑制作用，進而促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移［14］。以上研究提示，TIF1γ可能以抑癌或致癌因子的方式參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程，但其具體的作用方式與腫瘤的類型有關(guān)，具有復(fù)雜性。

TIF1γ在肺癌的表達與作用方式值得探討。我們的前期研究通過對60例肺癌患者癌組織及配對癌旁組織的免疫組化檢測，結(jié)果顯示TIF1γ在癌組織的陽性表達率61.6%，顯著高于配對癌旁組織3.3%，從而在蛋白質(zhì)層面證明了TIF1γ在肺癌患者的癌組織存在異常高表達［17］，這與Wang等［23］的報道不一致，推測可能與TIF1γ mRNA在肺癌組織存在轉(zhuǎn)錄后修飾有關(guān)。鑒于TIF1γ蛋白在肺癌患者癌組織的異常高表達，其在肺癌發(fā)生發(fā)展進程發(fā)揮何種作用方式值得探討。為此，本研究構(gòu)建TIF1γ過表達慢病毒與siRNA，分別轉(zhuǎn)染相對低表達與高表達TIF1γ的A549與H460肺癌細胞，從TIF1γ過表達/敲減兩個層面深入研究TIF1γ表達對肺癌細胞活力、凋亡、遷移與侵襲的影響。CCK-8法與流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示，TIF1γ過表達的A549細胞活力顯著低于陰性對照組，G0/G1期比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低，而TIF1γ敲減的H460細胞的變化則與之相反；與陰性對照組相比，TIF1γ過表達與敲減的肺癌細胞凋亡率均無顯著的改變。以上結(jié)果表明，TIF1γ表達可將細胞周期阻滯于G0/G1期，對肺癌細胞的活力具有顯著抑制作用，但并不導(dǎo)致細胞凋亡。在肺癌的不良預(yù)后中，癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致晚期癌癥患者死亡的重要原因。我們進一步通過Transwell實驗研究TIF1γ表達對肺癌細胞遷移與侵襲的影響，結(jié)果顯示，TIF1γ過表達的A549細胞穿過小室的細胞數(shù)目和穿過Matrigel至下室的細胞數(shù)目均顯著少于陰性對照組，而TIF1γ敲減的H460細胞的變化則與之相反。這些結(jié)果表明，TIF1γ表達除了抑制肺癌細胞的活力之外，還可顯著抑制遷移和侵襲的惡性生物學(xué)行為，提示TIF1γ可能在肺癌發(fā)生發(fā)展的進程中發(fā)揮抑癌因子的作用。而我們前期的研究顯示TIF1γ蛋白在肺癌組織存在異常的高表達，推測可能與病程進展致腫瘤惡性表型疊加，進而導(dǎo)致TIF1γ蛋白的代償性表達增多有關(guān)。

Figure 6.The effects of TIF1γ on the migration and invasion abilities of A549（A）and H460（B）cells.Scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Lenti-Ctrl group；##P＜0.01 vs si-Ctrl group.圖6 TIF1γ對肺癌A549和H460細胞遷移和侵襲能力的影響

綜上所述，本研究在前期檢測到TIF1γ蛋白在肺癌組織中存在異常高表達的基礎(chǔ)上，通過細胞體外實驗，從TIF1γ過表達/敲減兩個層面闡明TIF1γ可能是肺癌的一種潛在抑癌因子，其表達可抑制肺癌細胞的活力、遷移能力和侵襲能力，并將細胞周期阻滯于G0/G1期。對于TIF1γ參與肺癌發(fā)生發(fā)展進程的具體分子機制以及TIF1γ表達與患者病情評估、預(yù)后的相關(guān)性，有待后續(xù)的探討。