羅遠良， 李夢思， 滕嘉碩， 戴曉萌， 唐翔栩， 邢 云， 呂秀秀

（暨南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學系，國家中醫(yī)藥管理局病理生理重點實驗室，廣東廣州510000）

蒽環(huán)類化療藥物阿霉素（adriamycin）又稱多柔比星（doxorubicin，DOX），對白血病、淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等療效顯著［1-2］。然而，DOX具有明顯的心臟毒性，并且隨著使用過程中藥物劑量的累積，心臟損傷不斷加重，最終發(fā)展為心力衰竭。最近觀察到腫瘤幸存者在治療早期就會出現(xiàn)心臟舒張功能障礙，而此時并沒有伴有收縮功能障礙。心肌炎癥、纖維化以及間質(zhì)增生等均可引起心室順應性下降，進而影響舒張功能［3-5］。長期以來，心肌細胞被認為是DOX心臟毒性的經(jīng)典細胞靶點［6-11］。直到最近，心臟中其它類型細胞才被提出作為DOX心臟毒性的細胞靶點。心臟成纖維細胞占人心臟細胞總數(shù)的60%～70%，心臟成纖維細胞受到刺激時，可向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化，而肌成纖維細胞是纖維化過程中主要分泌細胞外基質(zhì)的細胞。隨著人們對各種心血管疾病的研究，心臟成纖維細胞在維持心功能方面的意義已被認可［12-13］。炎癥是纖維化的重要觸發(fā)因素。Riad等［14］發(fā)現(xiàn)TLR4敲除可減少氧化應激和炎癥反應，從而改善DOX性心肌病小鼠左室功能。然而，目前并沒有文獻報道細菌性感染參與了DOX性心肌病的發(fā)生發(fā)展。以上結(jié)果提示：非細菌性炎癥在DOX性心肌病中可能發(fā)揮著重要作用。

2010年Zhu等［15］報道，DOX可增加小鼠血清中白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）水平，預先給予IL-1受體的拮抗劑可降低小鼠死亡率，改善心功能，減輕心臟損傷及心肌凋亡。IL-1β是天然免疫中非常重要的促炎癥因子，其活化需經(jīng)過表達、成熟、分泌幾個階段［16-20］。Martinon等［21］在2002年首次提出IL-1β的成熟和分泌為炎癥小體所調(diào)節(jié)。炎癥小體有多種類型，但目前結(jié)構(gòu)和功能最為明確的僅有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體。NLRP3炎癥小體在結(jié)構(gòu)上包含3個主體部分：（1）NLRP3；（2）配體蛋白——含CARD的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）；（3）IL-1β轉(zhuǎn)換酶（IL-1β-converting enzyme，ICE）或 caspase-1［22-24］。越來越多證據(jù)表明NLRP3炎癥小體與非細菌性炎癥密切相關(guān)［25-28］。此外，已有研究表明心肌細胞/心臟成纖維細胞中NLRP3介導的非細菌性炎癥在病毒性心肌炎、糖尿病性心肌病、心肌梗死以及充血性心力衰竭中發(fā)揮重要作用［29-30］。心臟成纖維細胞表達天然免疫系統(tǒng)的成分，包括Toll樣受體和NOD樣受體，能快速感知內(nèi)源性危險信號。同時，心臟成纖維細胞亦能表達炎癥小體，從而促進IL-1β的激活和分泌［31-33］。但是，DOX對心臟成纖維細胞促炎癥因子IL-1β釋放以及促纖維化的作用及機制，目前尚未見報道。

材料和方法

1 動物

出生1～3 d的SPF級SD大鼠乳鼠，雌雄不限，采購于廣東省廣州市南方醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號為No.44002100012730。實驗操作嚴格按照暨南大學實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定進行

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；HEPES粉、PBS、HBSS和2.5%胰酶（HyClone）；含EDTA的胰酶和澳洲胎牛血清（Gibco）；青霉素和鏈霉素（Thermo Fisher）；5 mg DOX粉劑（暨南大學附屬第一醫(yī)院）和熒光素標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗（Abcam）；驢血清封閉液和CCK-8工作液（Dojindo）；annexin V-FITC/PI試劑盒（Sigma）；RIPA液、BCA試劑定量試劑和配膠試劑盒均購自碧云天公司；TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒（R&D）；本研究中所用的Ⅰ抗均購自Abcam。

3 主要方法

3.1 成纖維細胞的培養(yǎng)和鑒定 取SD大鼠乳鼠，雌雄不限，放入75%乙醇消毒5～10 s，經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，移入超凈臺內(nèi)，用眼科剪打開胸腔，用眼科彎鑷找到心臟，將取出的心臟置于預冷的PBS中，并使用眼科直鑷輕輕擠壓心臟兩側(cè)，盡量地去除心臟內(nèi)殘血。再使用眼科鑷將心臟組織夾到另外的已提前放入預冷的PBS的培養(yǎng)皿中，盡可能剪除依附著心臟表面的其他組織。用剪刀把心臟組織剪成一半，保留心臟的中間部位至心尖處，用眼科剪將其盡可能剪碎，用微量移液器加入心臟組織量5～10倍體積的0.125%胰酶，用滴管輕輕將組織塊吹散，蓋上已經(jīng)高壓的錫箔紙，置于37℃恒溫攪拌條件下消化。第1次消化7 min，棄上清。再次加入5～10倍的0.125%胰酶消化5 min，重復消化數(shù)大概為5～7次后，收集細胞上清液于離心管內(nèi)，并用微量移液器加入相同體積的完全培養(yǎng)基，終止胰酶的消化。將終止消化的細胞液放入高速低溫離心機中進行離心（800 r/min，4℃，7 min）。離心后得到細胞沉淀后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM液重新懸浮起細胞沉淀2次后，棄上清液。用配制好的完全培養(yǎng)基進行細胞沉淀的懸浮，合并每次所得細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，通過差速貼壁純化心臟成纖維細胞。根據(jù)實驗需要將細胞接種于共聚焦皿中繼續(xù)培養(yǎng)。成纖維細胞培養(yǎng)48 h后，采用免疫熒光法檢測波形蛋白對成纖維細胞進行鑒定。

3.2 CCK-8法檢測心臟成纖維細胞的活力 心臟成纖維細胞培養(yǎng)48 h后，分為對照組及1、2和4μmol/L DOX處理組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，每孔加入10μL的CCK-8工作液，混勻后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)90 min。用多功能全波長酶標儀在450和570 nm雙波長處讀取每個孔A值，計算出各組成纖維細胞的活力。

3.3 流式細胞儀觀察DOX對心臟成纖維細胞凋亡的影響 將心臟成纖維細胞種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，分為對照組和1μmol/L DOX組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用含有EDTA的胰酶，消化細胞4 min；然后加入500μL的完全培養(yǎng)基，終止消化，充分的混勻，收集于1.5 mL離心管中，4℃、1 000 r/min離心5 min。PBS緩沖液洗滌后，1 000 r/min再次離心5 min，收集細胞沉淀，并依此加入100μL Binding Buffer、2.5μL annexin V-FITC及2.5μL PI，室溫避光孵育15 min，加入200 μL Binding Buffer混勻，上機檢測。

3.4 ELISA試劑盒檢測心臟成纖維細胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量 將心臟成纖維細胞種于96孔板中，48 h后分組處理同3.3。分別在培養(yǎng)12和24 h后，收集細胞上清液，根據(jù)ELISA試劑盒的步驟依次進行操作，最后使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值，設(shè)定540或590 nm波長作為校正波長。繪制線性標準曲線，計算細胞上清中各種促炎癥因子的含量。

3.5 免疫熒光染色檢測心臟成纖維細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白（vimentin）和心肌肌鈣蛋白 I（cardial troponin I，cTnI）的表達 將心臟成纖維細胞種于6孔板中，48 h后分組處理同3.3。加藥處理48 h后，丟棄共聚焦皿中的培養(yǎng)基，加入PBS溶液洗皿3次，每次5 min。加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定30 min后，加入PBS緩沖液洗皿3次，每次5 min。加入0.3%的Triton X-100 1 mL，于4℃冰箱中放置5 min。PBS溶液洗滌洗皿3次，每次5 min。加驢血清封閉液1 mL，室溫封閉1 h。配制好Ⅰ抗（抗α-SMA抗體、抗vimentin抗體及抗cTnI抗體）溶液，4℃孵育過夜。Ⅱ抗室溫孵育1 h，加入DAPI染色，共聚焦顯微鏡下進行觀察。

3.6 免疫熒光檢測心臟成纖維細胞線粒體活性氧簇（mitochondrial reactive oxygen species，mROS）的釋放情況 將心臟成纖維細胞種于6孔板中，加藥處理同3.3。用13μL的DMSO溶液加入50μg的線粒體超氧化物粉劑中，充分的混勻溶解，配制成5 mmol/L線粒體超氧化物試劑。使用HBSS稀釋試劑，將線粒體超氧化物試劑稀釋制備成5μmol/L試劑工作液。向共聚焦皿中加入試劑工作液，放在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育細胞10 min，避光操作；用已恢復室溫的PBS緩沖液，洗滌細胞3次；最后每皿加入1 mL的PBS緩沖液，置于共聚焦顯微鏡下觀察。

3.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白水平 DOX處理心臟成纖維細胞24 h后，提取細胞。配制分離膠和濃縮膠，取15μL樣品行SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST漂洗3次，每次5 min（在搖床上進行），于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后，用Ⅰ抗［抗Ⅰ型膠原（collagen type I，Col I）抗體、抗轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）抗體、抗GAPDH抗體、抗NLRP3抗體和抗caspase-1抗體，均按1∶1 000稀釋］4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，山羊抗兔Ⅱ抗（1∶8 000）室溫孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min（在搖床上進行）。超敏ECL化學發(fā)光法顯色。采用目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表達水平。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，兩組間的均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05時認為兩者的差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 心臟成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

免疫熒光染色結(jié)果顯示，綠色熒光為vimentin，用來標記心臟成纖維細胞；紅色熒光為cTnI，用來標記心肌細胞；藍色熒光為DAPI，標記細胞核。差速貼壁1和2 h后，心肌細胞數(shù)量很少，而成纖維細胞數(shù)量占細胞總數(shù)95%左右，見圖1。將獲得的心臟成纖維細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡下觀察可見細胞完全貼壁，體型較小，呈多角形，胞質(zhì)較少且透亮。

2 DOX對心臟成纖維細胞的損傷作用

經(jīng)1、2和4μmol/L的DOX處理24和48 h后，心臟成纖維細胞的活力與對照組比較明顯下降（P＜0.05），其中2和4μmol/L的DOX處理48 h后，細胞相對活力遠低于50%，見圖2A。

利用annexin-V和PI共染色，可區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞。如圖2B所示，原代培養(yǎng)心臟成纖維細胞48 h，再用1μmol/L DOX處理24 h后，代表早期凋亡的Q4區(qū)及晚期凋亡的Q2區(qū)中細胞百分比都很低，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

Figure 1.Identification of neonatal rat cardiac fibroblasts（×100）.It can be seen from the results that the 2 h time point can ensure the purity of cardiac fibroblasts，and the number of cells is sufficient.圖1 心臟成纖維細胞的鑒定

1μmol/L DOX處理心臟成纖維細胞12和24 h，與對照組相比，細胞上清中IL-1β和IL-6的含量顯著增加（P＜0.05），并具有時間依賴性；但DOX處理心臟成纖維細胞12和24 h后TNF-α并沒有顯著增加，與對照組比較無顯著差異，見圖2C。

Figure 2.Effects of doxorubicin（DOX）on cardiac fibroblasts.A：the effect of different concentrations of DOX on the viability of cardiac fibroblasts at 24 and 48 h；B：cultured fibroblasts treated with DOX for 24 h were analyzed by flow cytometry with annexin V-FITC staining；C：the expression levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cardiac fibroblasts after DOX treatment were detected by ELISA.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 control group.圖2 DOX對心臟成纖維細胞的損傷作用

3 DOX對心臟成纖維細胞促纖維化的影響

α-SMA是一種標記平滑肌的肌動蛋白，當各種刺激因素導致成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞時，就會表達α-SMA。而肌成纖維細胞具有典型的親纖維化表型。如圖3A所示，對照組中成纖維細胞極少數(shù)α-SMA染色陽性；而1μmol/L DOX處理24 h后，其中既表達vimentin又表達α-SMA的肌成纖維細胞顯著增多。該部分結(jié)果提示DOX能促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化。

Ⅰ型膠原蛋白是膠原纖維的主要生物化學成分，亦是細胞外基質(zhì)的組成成分之一。1μmol/L DOX處理24 h后，Ⅰ型膠原蛋白表達量顯著增加，與對照組比較有顯著差異（P＜0.05），見圖3B。

TGF-β能夠調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原的產(chǎn)生。因此，我們進一步檢測心臟成纖維細胞在DOX作用下TGF-β含量的變化。如圖3B所示，1μmol/L DOX處理心臟成纖維細胞24 h后TGF-β水平和對照組相比沒有顯著差異。

Figure 3.The pro-fibrotic effect of doxorubicin（DOX）on cardiac fibroblasts.A：cardiac fibroblasts treated with DOX for 24 h showed the phenotypic transformation toward myofibroblasts（vimentin is labeled as fibroblasts，α-SMA is labeled as myofibroblasts，cTnI is labeled as cardiomyocytes，and DAPI is labeled as nuclei；×600）；B：the effects of DOX on the expression of collagen type I（Col I）and TGF-β1 in cardiac fibroblasts.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖3 DOX對心臟成纖維細胞促纖維化的作用

4 DOX促進心臟成纖維細胞釋放炎癥因子可能與mROS-NLRP3炎癥小體途徑相關(guān)

我們通過線粒體超氧化物試劑標記mROS，結(jié)果顯示，1μmol/LDOX處理6 h、12 h和24 h后心臟成纖維細胞中代表mROS的紅色熒光強度較對照組都有所增加，隨機選取5個不同區(qū)域，分別測得紅色熒光強度值，計算各組平均熒光強度值。DOX處理6和12 h后，心臟成纖維細胞中代表mROS的紅色熒光較對照組顯著增強（P＜0.05），見圖4。

Western blot結(jié)果顯示，給予1μmol/LDOX24 h后，心臟成纖維細胞NLRP3蛋白表達顯著增加。同時NLRP3炎癥小體中重要成分cleaved caspase-1水平也明顯升高，和對照組相比具有統(tǒng)計學意義（（P＜0.05），見圖5。

討 論

減輕DOX的慢性心臟毒性，是治療腫瘤過程中面臨的重要問題。這種毒性作用表現(xiàn)為劑量累積性和個體耐受差異性。對于化療患者來說，DOX慢性心臟毒性將成為其終生的潛在威脅。

Figure 4.Effect of doxorubicin（DOX）on mROS release in cardiac fibroblasts（×600）.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs 0 h group.圖4DOX對心臟成纖維細胞中mROS釋放的影響

Figure 5.Effect of doxorubicin（DOX）on NLRP3 and cleaved caspase-1 exprossion in cardiac fibroblasts.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 DOX對心臟成纖維細胞NLRP3和cleaved caspase-1表達的影響

隨著臨床檢測心功能手段不斷完善，用來評估心功能的指標不斷優(yōu)化，越來越多的研究顯示，在進行化療治療過程中或化療結(jié)束時，有些患者雖沒有明確的心功能障礙癥狀，但此時已經(jīng)出現(xiàn)了舒張功能障礙。目前，DOX引起舒張功能障礙的機制尚不完全清楚，心肌炎癥、纖維化以及間質(zhì)增生等等改變，均可引起心室順應性下降，進而造成舒張功能障礙。

本研究所用的心臟成纖維細胞為原代培養(yǎng)細胞。因此，我們通過免疫熒光檢測成纖維細胞特異性標志物—波形蛋白，對所獲得細胞進行鑒定，為保證細胞純度能用于后續(xù)實驗，隨后，我們檢測了不同濃度的DOX對心臟成纖維細胞活力的影響。實驗結(jié)果顯示：1、2和4μmol/L的DOX處理24 h和48 h后，心臟成纖維細胞活力顯著降低。但2μmol/L和4μmol/L的DOX處理心臟成纖維細胞48 h后，細胞活力遠遠低于50%。為了確保后面實驗細胞數(shù)量的穩(wěn)定性，所以我們選用1μmol/L的DOX來進行后續(xù)實驗。

我們進一步通過流式檢測細胞凋亡情況。結(jié)果顯示：DOX并沒有明顯增加心臟成纖維細胞的早期和晚期凋亡率。同時，利用ELISA測定心臟成纖維細胞上清中各種炎癥因子的含量，結(jié)果表明：1μmol/LDOX能促進心臟成纖維細胞釋放大量的IL-1β和IL-6，但對于心臟成纖維細胞分泌TNF-α并沒有顯著作用。炎癥是纖維化的重要觸發(fā)因素，本研究通過免疫熒光檢測心臟成纖維細胞中α-SMA的表達情況，觀察DOX促心臟成纖維細胞肌化的作用。結(jié)果顯示：DOX處理24 h后，成纖維細胞表達α-SMA顯著增多。此外，DOX處理24 h后，心臟成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白顯著增加。該部分結(jié)果提示：1μmol/LDOX并不能顯著誘導心臟成纖維細胞凋亡，但會促進心臟成纖維細胞釋放大量炎癥因子，使得心臟成纖維細胞受損、肌化，并產(chǎn)生大量Ⅰ型膠原蛋白。

目前在DOX心臟毒性中并沒有明確的細菌性炎癥相關(guān)的報道。因此，我們推測DOX引起的主要為非細菌性炎癥。越來越多證據(jù)表明NLRP3炎癥小體與非細菌性炎癥密切相關(guān)，正常靜息狀態(tài)下，NLRP3并不以NLRP3炎癥小體形式存在，必須在NLRP3激活物刺激后，NLRP3發(fā)生寡聚化，并通過其PYD募集含有同型PYD的ASC，再通過含有CARD的ASC募集pro-caspase-1，形成NLRP3炎癥小體促進pro-caspase-1進行自我剪切為活化的caspase-1 p10/p20四聚體，最后活化的caspase-1將pro IL-1β加工為成熟的IL-1β。但NLRP3炎癥小體活化的機制，目前還不明確，有學者提出：NLRP3激活物產(chǎn)生的ROS主要來源于線粒體［18］。為了進一步探究DOX促心臟成纖維細胞釋放炎癥因子的機制，我們檢測了心臟成纖維細胞在DOX作用下線粒體ROS表達情況、NLRP3以及活化的caspase-1蛋白水平。免疫熒光結(jié)果顯示：DOX處理心臟成纖維細胞6 h后，線粒體就能釋放ROS；同時DOX能顯著增加心臟成纖維細胞中NLRP3和cleaved caspase-1的水平。越來越多的研究表明，IL-1β可能是誘導IL-6表達的主要激活因子之一［34-36］。有研究表明：sIL-6R與IL-6結(jié)合，可促進心臟成纖維細胞生成膠原，并誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化。這很好地解釋了DOX雖然沒有改變經(jīng)典調(diào)節(jié)I型膠原相關(guān)蛋白TGF-β水平，但依然促進了I型膠原蛋白的分泌。

綜上所述，DOX可刺激心臟成纖維細胞線粒體釋放大量的ROS，引起NLRP3炎癥小體活化，進而刺激心臟成纖維細胞釋放大量炎癥因子，促進其肌化、分泌大量膠原，最終影響心臟順應性。