李智昱， 李夢(mèng)琦， 張成虎， 李博川， 何金龍， 梁德剛△， 艾 玎△

（1天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系，天津醫(yī)學(xué)表觀遺傳學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300070；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心血管外科，天津300052）

下肢外周動(dòng)脈疾?。╬eripheral arterial disease，PAD）在全世界影響超過(guò)兩億人，部分PAD患者存在嚴(yán)重肢體缺血，可導(dǎo)致行走能力的缺失和生活質(zhì)量的降低，造成社會(huì)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。PAD治療的基礎(chǔ)是血管重建，以防止肢體壞死和功能障礙［1］。動(dòng)脈生成是由血管內(nèi)皮細(xì)胞等介導(dǎo)的側(cè)支血管重建的過(guò)程［2］，在缺血性疾病中的治療作用不可或缺。

缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄介質(zhì)，可以直接或間接調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞中2%以上的基因，通過(guò)促進(jìn)血管生成、動(dòng)脈生成、血管重塑等過(guò)程來(lái)控制氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送［3］。研究表明，HIF-1α活性的高低與小鼠下肢缺血后血流灌注情況相關(guān)［4-6］，但其轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的具體分子機(jī)制目前尚不十分清楚。

Hippo-Yes相 關(guān) 蛋 白（Yes-associated protein，YAP）信號(hào)通路在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，經(jīng)典Hippo通路通過(guò)一系列激酶反應(yīng)最終導(dǎo)致下游效應(yīng)分子YAP/具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)YAP/TAZ降解或者在細(xì)胞漿中滯留，從而在控制器官大小、腫瘤生長(zhǎng)等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［7］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Hippo-YAP信號(hào)通路在心血管疾病中同樣至關(guān)重要［8］，如YAP可以介導(dǎo)血流動(dòng)力學(xué)導(dǎo)致的內(nèi)皮激活，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展［9］，內(nèi)皮細(xì)胞YAP也可以通過(guò)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）相結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)乳小鼠視網(wǎng)膜血管新生過(guò)程［10］。YAP為輔轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性［7-8］。已知在腫瘤細(xì)胞中，YAP和HIF-1α可以相互結(jié)合［11］，但YAP是否可以在內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)控HIF-1α仍然未知。

在本研究中，我們構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞特異性YAP過(guò)表達(dá)（EC-YAPtg）小鼠下肢缺血模型，試圖探究YAP促進(jìn)動(dòng)脈生成的分子機(jī)制，旨在為PAD的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

材料和方法

1 動(dòng)物和細(xì)胞

CAG-loxP-STOP-loxP-YAP1轉(zhuǎn)基因小鼠（YAPflox）以及內(nèi)皮特異性Tie-2啟動(dòng)子表達(dá)CRE的小鼠購(gòu)于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院。EC-YAPtg小鼠為以上兩種小鼠雜交所得。實(shí)驗(yàn)使用6～8周齡雄性小鼠。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）從天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院產(chǎn)科提供的臍帶中分離獲得；HEK293細(xì)胞購(gòu)于ATCC（貨號(hào)CRL-1573）。

2 主要試劑

抗HIF-1α抗體（貨號(hào)79233）、抗總YAP（total YAP，t-YAP）抗體（貨號(hào)4912）和抗Ser127位點(diǎn)磷酸化 YAP（phosphorylated YAP at Ser127，p-YAPS127）抗體（貨號(hào) 4911）購(gòu)于 Cell Signaling Technology；抗GAPDH 抗體（貨號(hào) 60004-1-lg）購(gòu)于 Proteintech；YAP-WT和YAP-5SA質(zhì)粒由浙江大學(xué)趙斌教授贈(zèng)送。

3 主要方法

3.1 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取HUVECs蛋白，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE（蛋白上樣量為20μg），轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入I抗并4℃孵育過(guò)夜，洗膜后II抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)。使用ImageJ軟件分析YAP總蛋白以及其磷酸化蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參照，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 用PBS清洗實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞或組織，使用4%多聚甲醛固定0.5 h，0.5%Triton X-100室溫處理0.5 h，并使用山羊血清工作液室溫封閉1 h，加入I抗于4℃濕盒過(guò)夜；使用PBS清洗后再加入熒光II抗室溫孵育1 h，PBS清洗后使用含有DAPI染料的封片劑封片；使用激光共聚焦顯微鏡拍照分析。

3.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 提取HUVECs蛋白，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量；取500μg蛋白質(zhì)樣品，加入特異性抗體，4℃孵育過(guò)夜；第2天加入瓊脂糖珠，4℃孵育過(guò)夜；最后加入SDS，100℃加熱5 min，再進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

3.4 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將HIF-1α螢光素酶報(bào)告基因載體（由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建）與LacZ、YAP-WT和YAP-5SA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后，收獲細(xì)胞；按螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒（Promega）說(shuō)明書檢測(cè)HEK293細(xì)胞螢光素酶活性；最后用ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.5 激光多普勒血流儀檢測(cè)小鼠下肢血流 分別于結(jié)扎股動(dòng)脈手術(shù)后1、8、15和22 d使用激光多普勒血流儀檢測(cè)小鼠下肢血流量情況。2組小鼠麻醉后仰臥，固定雙下肢，將多普勒光纖探頭固定至下肢，掃描并記錄下肢血流灌注情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用未配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)，多組間比較采用雙因素方差分析和Bonferroni校正后的t檢驗(yàn)。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

Figure 1.Hypoxia reduced YAP phosphorylation and promoted YAP nuclear translocation.A：Western blot analysis of expression of indicated proteins；B：HUVECs were exposed to nomoxia or hypoxia for 6 h，and immunofluorescence staining for YAP（red）and DAPI（blue）was performed.The scale bar=20 μm.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs 0 h.圖1 缺氧降低YAP蛋白磷酸化水平并增加其核轉(zhuǎn)位

結(jié) 果

1 缺氧降低YAP磷酸化水平并增加其核轉(zhuǎn)位

隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1α的表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)YAP蛋白第127位絲氨酸磷酸化水平呈時(shí)間依賴性下降，4 h和6 h下降最為顯著（P＜0.05），而總YAP蛋白水平?jīng)]有明顯改變，見圖1A。免疫熒光染色結(jié)果顯示，缺氧處理6 h顯著增加YAP蛋白在細(xì)胞核的定位，見圖1B。

2 YAP和HIF-1α在內(nèi)皮細(xì)胞中相互結(jié)合

既往研究顯示，YAP蛋白在肝癌細(xì)胞中可以和HIF-1α蛋白相互結(jié)合并促進(jìn)細(xì)胞的糖酵解過(guò)程［12］，但內(nèi)皮細(xì)胞中兩者是否存在結(jié)合尚不清楚。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺氧狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞YAP蛋白和HIF-1α蛋白存在相互結(jié)合，見圖2。

3 YAP上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性

在HEK293細(xì)胞中，將HIF-1α螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別與LacZ、YAP-WT和YAP-5SA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24 h后，檢測(cè)螢光素酶的活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照質(zhì)粒相比，YAP-WT質(zhì)粒能有效增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性（P＜0.05），YAP-5SA質(zhì)粒比YAP-WT質(zhì)粒能進(jìn)一步增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性（P＜0.05），見圖3。這表明YAP蛋白可以上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性。

4 YAP過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)缺氧組織的血流恢復(fù)

EC-YAPtg小鼠的構(gòu)建過(guò)程如圖4A所示。對(duì)ECYAPTg小鼠和對(duì)照小鼠（YAPflox）行股動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)，分別于術(shù)后1、8、15和22 d使用激光多普勒血流儀檢測(cè)小鼠下肢血流恢復(fù)情況。與YAPflox小鼠相比，EC-YAPtg小鼠下肢的血流灌注顯著增加（P＜0.05），見圖4B。這提示YAP蛋白過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)小鼠缺氧組織的血流恢復(fù)。

5 YAP能夠促進(jìn)動(dòng)脈生成

進(jìn)一步提取EC-YAPtg小鼠和YAPflox小鼠腓腸肌并且進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)CD31、α-SMA及Mac3表達(dá)水平。相比于YAPflox小鼠，EC-YAPtg小鼠肌肉中CD31和α-SMA表達(dá)明顯增高（P＜0.05），而Mac3表達(dá)沒有明顯變化（P＞0.05），見圖5。這表明YAP過(guò)表達(dá)促進(jìn)了缺血組織中動(dòng)脈生成。

Figure 2.Identification of HIF-1α as YAP-binding partner.Coimmunoprecipitation（IP）assay was performed using extracts of HUVECs and anti-YAP/HIF-1α antibody.Rabbit normal IgG was used as control.Immunoblotting was performed with the indicated anti-HIF-1α or anti-YAP antibody.圖2 YAP蛋白和HIF-1α蛋白相互結(jié)合

Figure 3.YAP up-regulated the transcriptional activity of HIF-1α.HIF-1α promoter luciferase reporter plasmid was cotransfected into HEK293 cells with LacZ，YAP-WT or YAP-5SA plasmids for 24 h.The promoter activity was measured by luciferase reporter assay，which was normalized to β-galactosidase.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs LacZ group；#P＜0.05 vs YAP-WT group.圖3 YAP增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性

討 論

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，缺氧通過(guò)調(diào)控YAP第127位絲氨酸磷酸化而促進(jìn)YAP入核與HIF-1α相互結(jié)合，并可能通過(guò)上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控缺血后動(dòng)脈生成過(guò)程。

HIF-1α在調(diào)節(jié)缺氧/缺血相關(guān)的疾病中被證實(shí)可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控血管活性、血管新生、動(dòng)脈生成，以及骨髓來(lái)源細(xì)胞的遷移和歸巢等過(guò)程，進(jìn)而在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［6］。研究證實(shí)HIF-1α可以作為細(xì)胞內(nèi)的氧氣感受器存在：氧氣濃度增加時(shí)，HIF-1α被羥基化并與希佩爾-林道腫瘤抑制因子（von Hippel-Lindau tumor suppressor，VHL）相互作用，最終導(dǎo)致HIF-1α的泛素化修飾以及降解；缺氧時(shí)HIF-1α的羥基化修飾過(guò)程被抑制，進(jìn)而泛素化修飾以及降解過(guò)程被抑制［13］。已有報(bào)道證實(shí)HIF-1α在缺血相關(guān)的動(dòng)脈生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HIF-1α+/-小鼠相比于對(duì)照鼠，其下肢缺血后血流恢復(fù)速度更慢，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控眾多與血管新生以及動(dòng)脈生成相關(guān)的基因，包括血管生成素1（angiopoietin 1，ANGPT1）、ANGPT2、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（stem cell growth factor，SCF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等［4］。因此，鑒于HIF-1α在血管新生以及動(dòng)脈生成中的重要作用，使用藥物干預(yù)或者基因治療來(lái)提高HIF-1α的活性，可以成為治療缺血性疾病的新策略［3］。研究證實(shí)，通過(guò)局部注射CoCl2或者二甲基乙二?；拾彼幔╠imethyloxalylglycine，DMOG）可以提高HIF-1α的表達(dá)進(jìn)而改善損傷后的修復(fù)過(guò)程［5，14］。同時(shí)，腺病毒過(guò)表達(dá)持續(xù)激活形式的HIF-1α也可以促進(jìn)2型糖尿病小鼠下肢缺血后血流恢復(fù)［15］。我們的研究證實(shí)了YAP可以與HIF-1α相互結(jié)合并且促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性，YAP可以作為內(nèi)源性HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性的激活蛋白存在。此外，通過(guò)構(gòu)建EC-YAPtg小鼠我們也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞YAP過(guò)表達(dá)可以改善小鼠下肢缺血后血流灌注情況，促進(jìn)動(dòng)脈生成。

血管生成，即從已有血管網(wǎng)中形成新的血管，常見于發(fā)育過(guò)程中［16］；動(dòng)脈生成，是指現(xiàn)有的側(cè)支血管的擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞增殖后，平滑肌細(xì)胞有絲分裂，彈性層內(nèi)破裂，血管平滑肌細(xì)胞遷移形成新內(nèi)膜，一般見于出生后動(dòng)脈網(wǎng)的延伸或缺血損傷后天然微血管側(cè)支小動(dòng)脈轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ軇?dòng)脈等過(guò)程［17］。動(dòng)脈生成與血管生成在觸發(fā)因素、參與細(xì)胞及分子調(diào)控等方面存在不同［17-19］。我們之前的研究以及他人的研究均發(fā)現(xiàn)YAP在VEGF信號(hào)通路調(diào)控過(guò)程中具有重要作用［10，20］，同時(shí)也證實(shí)了 YAP在血管內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)增加STAT3在細(xì)胞核的滯留時(shí)間進(jìn)而增加ANGPT2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而促進(jìn)乳小鼠視網(wǎng)膜血管新生過(guò)程［10］，但YAP是否在動(dòng)脈生成過(guò)程中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用尚不清楚。本研究中，我們采用經(jīng)典的動(dòng)脈生成模型［21］，而且小鼠腓腸肌冰凍切片免疫熒光染色的結(jié)果表明，相比于YAPflox小鼠，EC-YAPtg小鼠腓腸肌中成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA［22］的表達(dá)水平明顯升高，巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Mac3無(wú)明顯變化。這一結(jié)果提示內(nèi)皮細(xì)胞YAP可以促進(jìn)動(dòng)脈生成過(guò)程，促進(jìn)小鼠缺血后下肢血流的恢復(fù)。

Figure 4.Over-expression of YAP promoted blood flow recovery in mice after hind-limb ischemia.A：loxP-flanked STOP cassette was used to control YAP expression in tissue by mating mice with an endothelial-specific Cre mouse line；B：hind-limb ischemia was surgically induced in EC-YAPtgmice and their wild-type littermates（YAPflox），and blood flow was evaluated by laser Doppler imaging on days 1，8，15 and 22.Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs YAPfloxgroup on day 22.圖4 YAP過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)下肢缺血后血流恢復(fù)

Figure 5.YAP overexpression promoted arteriogenesis.Gastrocnemius was extracted from YAPfloxand EC-YAPtgmice after ligation of femoral artery.Immunofluorescence staining for CD31（red），α-SMA（green），Mac3（red）and DAPI（blue）was performed.The scale bar=100μm.Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs YAPfloxgroup.圖5 YAP過(guò)表達(dá)促進(jìn)下肢缺血后血管生成

綜上所述，缺氧刺激可調(diào)節(jié)YAP磷酸化水平進(jìn)而促進(jìn)YAP核轉(zhuǎn)位；YAP可以與HIF-1α結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性；特異性內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)YAP可以促進(jìn)小鼠下肢缺血后動(dòng)脈生成過(guò)程。本研究為缺血后動(dòng)脈生成過(guò)程的分子機(jī)制研究提供了新思路；同時(shí)提示缺氧誘導(dǎo)的YAP入核參與了下肢缺血后動(dòng)脈生成過(guò)程，并可能成為新的治療靶點(diǎn)。