闞海峰，陸明霞，黃繼濤，高士祥

(1.福建省特色生物化工材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，綠色能源與環(huán)境催化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧德師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建 寧德 352100;2.污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023)

碳納米管(CNTs)是一種人工合成的碳材料，于1991年被Ijima[1]發(fā)現(xiàn)，其碳結(jié)構(gòu)十分奇特，為石墨片層圍繞中心軸螺旋卷曲而產(chǎn)生的管狀物[2]。Serag[3]等人利用TEM技術(shù)發(fā)現(xiàn)，多壁碳納米管(MWCNTs)可以穿透植物原生質(zhì)體的細(xì)胞膜進(jìn)入到植物細(xì)胞內(nèi)。文獻(xiàn)[4]表明，石墨烯能在大型蚤的體內(nèi)富集，且大型蚤體內(nèi)富集的大量石墨烯能夠從母代傳遞到子代，從而對(duì)下一代大型蚤的生長(zhǎng)和群體行為產(chǎn)生危害。Smith[5]和Federici[6]的研究表明碳納米材料能夠影響魚類的生理功能、損害魚的器官組織，尤其是魚鰓受到傷害最明顯，同時(shí)造成魚的生化指標(biāo)紊亂。文獻(xiàn)[5]顯示，經(jīng)質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/L的單壁碳納米管暴露10 d，虹鱒魚的各項(xiàng)生理功能受到顯著影響，生化指標(biāo)異常，病理切片出現(xiàn)明顯癥狀，暴露時(shí)間增加還會(huì)出現(xiàn)腫瘤。

抗氧化防御系統(tǒng)是生物體受到外源污染物入侵時(shí)的敏感系統(tǒng)，可以作為污染物低劑量長(zhǎng)期暴露的敏感生物指標(biāo)，已有多位學(xué)者研究了碳納米管、石墨烯和納米二氧化鈦對(duì)魚和其他生物肝臟的損傷和抗氧化防御系統(tǒng)的影響[5-7]?，F(xiàn)選取2種典型碳納米管單壁碳納米管(SWCNT)和羥基多壁碳納米管(MWCNT-OH)進(jìn)行低濃度亞急性半靜態(tài)暴露，研究低濃度亞急性暴露下2種典型碳納米材料對(duì)錦鯽肝臟和鰓的損傷以及對(duì)錦鯽抗氧化防御系統(tǒng)影響，初步探討了2種碳納米管的暴露濃度、暴露時(shí)間與毒性效應(yīng)的關(guān)系，以期為評(píng)價(jià)低濃度碳納米管暴露對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，篩選合適的生物標(biāo)志物提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 材料

SWCNT，純度>95%(深圳市納米港有限公司)；MWCNT-OH(深圳市納米港有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)，純度>97%(美國(guó)Tedia公司)；實(shí)驗(yàn)室用的錦鯽[Carassiusauratus，(25.0±7.5)g, (12.0±0.5)cm](南京市水產(chǎn)研究所祿口養(yǎng)殖基地)；錦鯽餌料(南京水產(chǎn)研究所)；試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和用具

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY88-Ⅱ)，超聲功率10～250 W，破碎容量0.2～200 mL(南京以馬內(nèi)利公司)；紫外可見分光光度計(jì)(Unico UV2000 spectrometry)(上海麗度電子科技發(fā)展有限公司)。加熱棒、尼龍抄網(wǎng)、曝氣頭等養(yǎng)魚器具不可混用，需用稀鹽酸浸泡、洗滌劑清洗和自來(lái)水沖洗后使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)前處理

各稱取100 mg SWCNT和 MWCNT-OH粉末，放于1 L的燒杯中，加入1 L超純水，將探頭伸入燒杯中，調(diào)節(jié)底座高度，使探頭末端接近底部約2 cm，超聲納米管的功率為75 W，超聲3 s后，間歇3 s。經(jīng)過(guò)10 h超聲破碎的碳納米管分散液很穩(wěn)定，長(zhǎng)期靜置后未發(fā)現(xiàn)沉淀。

1.4 暴露實(shí)驗(yàn)

選擇健康、無(wú)明顯疾病和肉眼可見損傷的錦鯽，暴露在室內(nèi)模擬條件下進(jìn)行半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)。用活性炭?jī)艋渥闫貧庾詠?lái)水，要求溶解氧達(dá)5.0 mg/ L，酸堿度pH 值(7.5 ± 0.4)，水溫約22 ℃。在實(shí)驗(yàn)室條件下，錦鯽馴養(yǎng)>15 d，健康無(wú)病害，每天按時(shí)按量投餌，一次投喂餌料適中，每日連續(xù)曝氣，使水中溶解氧充足。為保證碳納米管每天的暴露濃度大致保持在同一水平，換水時(shí)須加入一定體積且預(yù)先配置好的碳納米管母液。

將錦鯽隨機(jī)劃分若干處理組， SWCNT和MWCNT-OH分別設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度組單獨(dú)暴露(0, 10, 100, 1 000 μg/L)；光暗比為14 h∶10 h，喂食量每條魚每天約1.2 mg，一天一次或分多次，記錄魚的體長(zhǎng)和質(zhì)量；每天及時(shí)清除食物殘?jiān)图S便。

樣品采集時(shí),從每個(gè)暴露組撈取5條錦鯽，用鈍器擊昏，用預(yù)冷的緩沖液沖洗，置于冰塊上，稱量魚質(zhì)量、測(cè)量體長(zhǎng)；迅速把錦鯽腮及肝臟取出,稱重，置于冰浴中，用冷的生理鹽水沖洗干凈，加入1∶9(質(zhì)量體積比)的冷生理鹽水，用手持式電動(dòng)勻漿機(jī)冰浴勻漿，高速冷凍離心機(jī)12 000 r/min于-4 ℃離心15 min，上清液立即用于分別測(cè)定肝臟中蛋白質(zhì)含量及酶活性。

1.5 H&E 染色切片

解剖錦鯽后迅速取出肝臟和腮組織，用10%福爾馬林緩沖溶液固定48 h，自來(lái)水清洗用6—7 h，干燥和石蠟包埋。包埋好的肝臟和腮組織用切片機(jī)切片，厚度控制在5 μm，用蘇木精-伊紅(HE)染色劑染色，完全著色后，再進(jìn)行二次脫水，浸入伊紅染液，染色完成后，梯度脫水和透明。用Nikon Eclipse Ti-U 成像系統(tǒng)拍攝病理圖片。切片制作過(guò)程都能做到一次進(jìn)行脫水、透明、滲透、石蠟包埋和切片。

1.6 生物標(biāo)志物分析

超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定方法按照文獻(xiàn)[8]，對(duì)在次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶生成 O2·體系中細(xì)胞色素 c 還原的抑制情況加以評(píng)估。過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[9]；蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法按照文獻(xiàn)[10]，采用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel、SPSS 19.0軟件對(duì)測(cè)得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，酶活所有結(jié)果用5次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用差異性分析(ANOVA)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析，p< 0.05 表示在統(tǒng)計(jì)上有顯著差異，采用Origin 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 SWCNT和MWCNT-OH暴露對(duì)錦鯽的肝和鰓組織影響

圖 1和2是經(jīng)14 d暴露后，從顯微鏡中觀察到的錦鯽肝和鰓組織的典型圖片。圖1中黑箭頭：動(dòng)脈瘤；綠箭頭：腮絲抬升；紅箭頭：水腫。圖2中黃箭頭：壞死；綠箭頭：空泡；紅箭頭：細(xì)胞腫大。

通過(guò)切片圖的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2種典型碳納米管不論濃度高低都會(huì)對(duì)錦鯽魚鰓產(chǎn)生損傷，低濃度染毒會(huì)產(chǎn)生鰓絲擴(kuò)張、腫大，高濃度染毒(1 000 μg/L)可使魚鰓失去功能的嚴(yán)重病理癥狀，如畸形生長(zhǎng)、

(a)0；(b) SWCNT (10 μg/L) 沒(méi)有變化；(c) MWNT-OH (10 μg/L) 沒(méi)有變化；(d) SWCNT (1 000 μg/L)； (e) MWNT-OH (1 000 μg/L)。圖1 SWCNT，MCWNT-OH 2種碳納米管各自暴露下14 d錦鯽鰓損傷切片

(a) 0；(b) SWCNT (10 μg/L) 沒(méi)有變化 (c) MWNT-OH (10 μg/L) 沒(méi)有變化； (d) SWCNT (1 000 μg/L)；(e) MWNT-OH (1 000 μg/L)。圖2 SWCNT，MCWNT-OH 2種碳納米管各自暴露下14 d錦鯽肝臟損傷切片圖

鰓動(dòng)脈瘤和鰓細(xì)胞水腫。說(shuō)明碳納米管可以對(duì)魚鰓產(chǎn)生較嚴(yán)重的傷害，這可能是因魚在水里不停的呼吸，不斷的過(guò)濾水中的碳納米管，由于碳納米管的孔徑和長(zhǎng)度都比較小，能夠進(jìn)入腮組織，從而對(duì)鰓造成傷害[11]。腮是魚一個(gè)多功能和復(fù)雜組織，魚要通過(guò)腮呼吸和過(guò)濾大量的水，所以魚腮相比較其他器官更易受環(huán)境中毒物影響[11]，尤其對(duì)碳納米管更加敏感[12]。

高濃度的SWCNT，MWCNT-OH對(duì)錦鯽肝臟造成輕微的損傷，肝細(xì)胞出現(xiàn)炎癥和細(xì)胞浸潤(rùn)以及小的脂肪空泡等癥狀；而低濃度染毒14 d時(shí)，碳納米管對(duì)魚肝不造成損害。Tabei[13]研究發(fā)現(xiàn)MWCNT能夠進(jìn)入細(xì)胞中去，并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，毒性大小與細(xì)胞內(nèi)存在MWCNT多少有關(guān)。文獻(xiàn)[7]研究證明肝臟也是易受碳納米材料攻擊的器官，并錦鯽肝臟的SOD和 CAT受到抑制與碳納米材料的濃度呈正相關(guān)，肝臟的氧化損傷從高濃度染毒組(1 000 μg/L)肝切片也可以看到肝臟受損傷，干細(xì)胞腫大，出現(xiàn)小空泡(不同顏色箭頭已經(jīng)表明)。Smith[5]研究表明，暴露于SWCNT的肝細(xì)胞顯示核小體(凋亡小體)和核分裂異常的細(xì)胞，二氧化鈦納米材料暴露后，肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微的脂肪變化和脂質(zhì)化，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)化，顯示濃縮核小體(凋亡小體)[6]。

2.2 SWCNT和MWCNT-OH暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響

圖3(a)(b)給出了SWCNT不同質(zhì)量濃度(10, 100 和1 000 μg/L)暴露28 d后肝臟SOD和 CAT活力的變化趨勢(shì)。圖中數(shù)據(jù)為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)；不同字母，表示與對(duì)照組相比的顯著性差異(p<0.05)。

圖3 SWCNT不同濃度組染毒28 d后對(duì)錦鯽肝臟抗氧化酶(SOD和 CAT)活性的影響

SWCNT染毒7 d后，高質(zhì)量濃度組(1 000 μg/L)SOD酶活性顯著受到誘導(dǎo)(p<0.05)，其酶活性增加；隨著暴露天數(shù)增加，14 d后，質(zhì)量濃度100和1 000 μg/L組SOD酶活性受到抑制；暴露21—28 d，各染毒組SOD酶活性都受到顯著的抑制(p<0.05)，肝臟受到損傷。

SWCNT暴露7 d后，100 μg/L組的CAT受到抑制，其他組酶活變化不大；14 d后，10和1 000 μg/L組CAT活X性受到抑制，而100 μg/L組受到誘導(dǎo)，酶活升高；21 d后，10 μg/L組CAT酶活升高但不顯著，100 和1 000 μg/L組CAT酶活受到顯著的抑制(p<0.05)，酶活降低；暴露28 d后，各染毒組CAT都受到顯著的抑制(p<0.05)，表明肝臟受到損傷。

單壁碳納米管能夠?qū)е略孱愌趸瘧?yīng)激和抑制其生長(zhǎng)[14]。Kang[15]認(rèn)為單壁納米管對(duì)人和動(dòng)物顯示較強(qiáng)的毒性，而多壁碳納米管顯示較溫和的毒性。Shvedova[16]認(rèn)為納米材料都能使動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞損傷。碳納米管能導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)抗氧化系統(tǒng)損傷[17]。

圖4(a)(b)給出了MWCNT-OH不同質(zhì)量濃度(10， 100和1 000 μg/L)暴露28 d后肝臟SOD和CAT活力的變化趨勢(shì)。圖中數(shù)據(jù)為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)；不同字母，表示與對(duì)照組相比的顯著性差異(p<0.05)。

圖4 MWNT-OH不同濃度組染毒28 d后對(duì)錦鯽肝臟抗氧化酶(SOD和CAT)活性的影響

MWCNT-OH染毒7 d后，10 和100 μg/L組與空白對(duì)比SOD變化不大，1 000 μg/L組 SOD酶顯著受到誘導(dǎo)(p<0.05)，其酶增加；暴露14 d后，10 和100 μg/L組與空白對(duì)比SOD酶變化不大，而1 000 μg/L 組SOD酶活升高，但變化不顯著；21 d后，10 μg/L組SOD酶受到顯著的抑制(p<0.05)，SOD減小，其他濃度組變化不顯著；28 d后，10 μg/L組SOD活變化不顯著，100 和1 000 μg/L組SOD酶活受到顯著的抑制(p<0.05)，其酶減小，肝臟受到損傷。

MWCNT-OH染毒7 d后，10和100 μg/L組CAT酶活變化不顯著，1 000 μg/L組 CAT酶活受到顯著的誘導(dǎo)(p<0.05)，酶活升高；14 d后，10 和100 μg/L組CAT酶活變化不顯著，1 000 μg/L 組CAT酶活受到顯著的抑制(p<0.05)，酶活降低，肝臟受到損傷；21 d后，10 μg/L組CAT活變化不顯著，而100 和1 000 μg/L組CAT活受到顯著的抑制(p<0.05)，CAT減小，肝臟受到損傷；28 d后CAT，各染毒組都受到顯著的抑制(p<0.05)，CAT酶活減小，肝臟受到損傷。

文獻(xiàn)[18-21]研究表明，碳納米管會(huì)對(duì)人胚胎腎細(xì)胞、老鼠肺細(xì)胞和魚的抗氧化系統(tǒng)造成損傷。MWCNT碳納米管由于長(zhǎng)度、形狀、硬度和其他性質(zhì)的不同導(dǎo)致生物毒性的不同[22]。本研究表明，SWCNT和MWCNT-OH作為外援物質(zhì)進(jìn)入魚體，激起活性氧的升高，而抗氧化酶系統(tǒng)為了對(duì)抗活性氧的升高，SOD和CAT增加，當(dāng)活性氧產(chǎn)生速度超過(guò)抗氧化酶速度，抗氧化酶受到抑制，肝臟受到損傷。雖然SWCNT和MWCNT-OH對(duì)魚類的毒性很小，但可對(duì)錦鯽肝臟造成輕微的損傷。許多濃度組出現(xiàn)的酶變化情況表明，碳納米管暴露會(huì)給魚體帶來(lái)了氧化應(yīng)激，導(dǎo)致了活性氧自由基等氧化物質(zhì)的積累，隨著濃度增大和染毒天數(shù)增加，抑制抗氧化酶的產(chǎn)生。這種變化就形成抗氧化酶防御機(jī)制中的“自適應(yīng)階段”和“抑制階段”，“適應(yīng)階段”是外源物質(zhì)的進(jìn)入誘導(dǎo)抗氧化酶活性的增加，抗氧化酶就能維持機(jī)體正常的生理生化平衡；“抑制階段”，當(dāng)抗氧化酶不能維持機(jī)體正常的生理生化平衡，酶活顯著減少，受到顯著的抑制，活性氧的累積水平己超過(guò)抗氧化防御水平的清除能力[8]。

實(shí)驗(yàn)期間，設(shè)置了多濃度組與多采樣時(shí)間點(diǎn)，魚體內(nèi)的SOD和CAT的酶活強(qiáng)度呈現(xiàn)多樣化的變化，這種變化間接反映了SWCNT和MWCNT-OH暴露能促進(jìn)魚體產(chǎn)生不同的生物活性物質(zhì)。低濃度組染毒早期，呈現(xiàn)SOD和CAT酶活性受到誘導(dǎo)；而高濃度組染毒時(shí)間增加，SOD和CAT都相應(yīng)降低，SOD和CAT受到抑制。總之，外源物質(zhì)的進(jìn)入會(huì)引起氧化壓力強(qiáng)度和氧化脅迫持續(xù)變化，抗氧化酶共同發(fā)揮作用，以維持活性氧產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和規(guī)律可以判斷，高濃度SWCNT和MWCNT-OH進(jìn)入錦鯽體內(nèi)后，一方面抑制SOD、CAT等抗氧化酶活性，從而增加了錦鯽體內(nèi)活性氧的積累；另一方面低濃度時(shí)SWCNT和MWCNT-OH的進(jìn)入也會(huì)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，過(guò)量積累的活性氧反過(guò)來(lái)消耗SOD、CAT，SOD、CAT酶活降低，錦鯽組織受到損傷。Ganguly[23]研究認(rèn)為，單壁碳納米管能誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，增加細(xì)胞死亡，提高DNA損傷。SWCNT和MWCNT-OH可以誘導(dǎo)錦鯽體內(nèi)的活性氧的產(chǎn)生，在實(shí)驗(yàn)早期階段，機(jī)體為了消除過(guò)量的活性氧，加速合成SOD、CAT，表現(xiàn)為SOD、CAT受到誘導(dǎo)，酶活性提高，之后由于活性氧的積累，超過(guò)了機(jī)體的調(diào)節(jié)功能，影響SOD、CAT的合成，表現(xiàn)為SOD、CAT活性的下降，此推斷符合Mittler[24]的活性氧學(xué)說(shuō)。

研究發(fā)現(xiàn)隨著染毒時(shí)間增加，28 d后，SWCNT和MWCNT-OH高濃度組的SOD和CAT活力均顯著降低，說(shuō)明高濃度下碳納米管能抑制SOD和CAT活力, 這與朱小山[25]用SWCNT染毒錦鯽的結(jié)果是一致的。SOD和CAT活力降低，抗氧化系統(tǒng)受到抑制，錦鯽肝臟內(nèi)超氧自由基上升，肝功能已經(jīng)無(wú)法對(duì)抗這種變化，肝臟受到損傷。經(jīng)過(guò)7 d后染毒，SWCNT和MWCNT-OH在暴露質(zhì)量濃度為10和100 μg/L時(shí)，錦鯽肝臟SOD酶活性變大，暴露初期，會(huì)誘導(dǎo)SOD酶活來(lái)對(duì)抗外源物質(zhì)干擾。中等濃度和高濃度組隨著暴露時(shí)間增加SOD和CAT活力大都出現(xiàn)顯著下降，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間暴露于碳納米管對(duì)超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性有顯著的抑制作用，可能對(duì)魚的肝臟造成損傷。

3 結(jié)論

研究評(píng)估了亞急性低濃度暴露條件下SWCNT和MWCNT-OH對(duì)錦鯽肝臟和鰓組織的損傷和肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)SWCNT和MWCNT-OH都對(duì)鰓造成了不同程度的損傷，高濃度暴露損傷較嚴(yán)重，低濃度組造成的損傷較輕，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；低濃度SWCNT和MWCNT-OH對(duì)錦鯽肝臟損傷不明顯，可能與碳納米管毒性較小，難以進(jìn)入肝臟有關(guān)。雖然碳納米管的毒性較低，但其長(zhǎng)期暴露對(duì)魚類的影響仍需進(jìn)一步關(guān)注。