傅一挺，吉莉，陳延松

(合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601)

20世紀(jì)80年代以來(lái)，納米材料因其獨(dú)特的物理、化學(xué)、生物性能，被廣泛應(yīng)用于光電、能源、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域中。近年來(lái)，隨著納米科技的迅速發(fā)展，它一方面促進(jìn)了世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展并對(duì)人類生活產(chǎn)生了重要影響；但另一方面，納米材料尤其是金屬納米材料[1-2]對(duì)動(dòng)物、植物、微生物乃至人類的毒性也越來(lái)越多地被人們關(guān)注。

金屬納米材料在其生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用過(guò)程中易被釋放到大氣、土壤或水環(huán)境中，進(jìn)而對(duì)生命有機(jī)體產(chǎn)生影響[3]。實(shí)踐研究表明，金屬納米材料對(duì)植物的生態(tài)毒性已成為一個(gè)倍受關(guān)注的全新領(lǐng)域。然而，不同金屬納米材料對(duì)不同植物產(chǎn)生毒性的機(jī)理不同，這主要取決于它們本身的理化性質(zhì)、受試植物和環(huán)境介質(zhì)[4-6]。

納米氧化鋅(nano-ZnO)具有優(yōu)良的吸收紫外線、抗菌消毒等特點(diǎn)，是一種應(yīng)用范圍很廣的金屬納米材料。研究表明，nano-ZnO對(duì)細(xì)菌[7]、藻類[8]、動(dòng)物[8]、植物[9]等均具有急性或慢性生態(tài)毒性。nano-ZnO對(duì)植物的毒性一方面來(lái)自納米顆粒本身，另一方面則來(lái)自釋放出的鋅離子，尤其是在酸性條件下，超過(guò)60%的nano-ZnO會(huì)釋放出鋅離子至溶液中[5]。植物體中濃度過(guò)高的鋅離子會(huì)對(duì)植物的生理生態(tài)特性及其生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[10]。然而，目前有關(guān)nano-ZnO的植物毒性研究主要是基于水培條件下完成的[5,9,11-12]，更缺乏酸性條件下植物對(duì)長(zhǎng)期暴露的脅迫響應(yīng)。現(xiàn)以蕹菜(IpomoeaaquaticaForsk.)為受試植物，通過(guò)土培盆栽實(shí)驗(yàn)，探究弱酸性條件下nano-ZnO長(zhǎng)期脅迫對(duì)蕹菜的生理生態(tài)效應(yīng)。研究結(jié)果將拓寬對(duì)nano-ZnO與植物相互關(guān)系的認(rèn)識(shí)，也可為nano-ZnO的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蕹菜種子300 g/袋(北京大禾龍騰國(guó)際種子有限公司，約10 000粒)；nano-ZnO[上海阿拉丁工業(yè)公司,純度為99.9%，顆粒粒徑為(30±10)nm]；栽培盆(盆口直徑16.0 cm，盆底直徑12.5 cm，盆高17.0 cm)。

弱酸性土壤配制：將購(gòu)自市場(chǎng)的酸性營(yíng)養(yǎng)土與林下0～15 cm表層土按體積比1∶1充分混勻，自然晾干后待用。經(jīng)檢測(cè)，主要物質(zhì)質(zhì)量比為有機(jī)質(zhì)58.16 g/kg，總氮3.26 g/kg，總磷2.20 g/kg，總鉀13.12 g/kg，pH值=6.05。

1.2 樣品處理

1.2.1 土壤處理

將干燥后的混合土壤去除雜質(zhì)，均分為8組，每組分別按鋅質(zhì)量比0，5，10，20，40，80，160 mg/kg施加nano-ZnO，充分?jǐn)嚢?0～15 min，混勻后等份裝盆，每組操作重復(fù)5次。

1.2.2 種子萌發(fā)與幼苗栽培處理

選取飽滿且大小均勻的健康蕹菜種子200粒，用50～60 ℃的溫水浸種30 min后，于清水中浸種20 h，取出洗凈，置于室溫下濕潤(rùn)的紗布上催芽。待種子胚根突破種皮，隨機(jī)取其中140粒，種入上述經(jīng)過(guò)nano-ZnO處理的土壤中。每盆均勻播種4粒種子，播種完后用封口膜包裹密封栽培盆盆口，再置于人工氣候室中培養(yǎng)。幼苗建成后，每天澆水以保持土壤濕潤(rùn)。人工氣候室條件設(shè)定為光照12 h，溫度30 ℃，光照強(qiáng)度為200 μmol/(m2·s)；黑暗12 h，溫度25 ℃，相對(duì)濕度(55±5)%。

整個(gè)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2017年11月19日—2018年1月26日。在培養(yǎng)階段的最后一周內(nèi)進(jìn)行葉綠素相對(duì)含量、形態(tài)學(xué)指標(biāo)、生物量以及葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)量。各項(xiàng)指標(biāo)均以每盆4株植物的平均值為一個(gè)重復(fù)觀測(cè)值，n=5。

1.3 測(cè)定方法

形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定：使用直尺測(cè)定株高，計(jì)數(shù)法記錄葉片數(shù)目。

葉綠素相對(duì)含量(SPAD)的測(cè)定：采用SPAD-502 Plus(Minolta Japan,Konica)葉綠素計(jì)測(cè)量。以植物形態(tài)學(xué)上端第一片完全展開的葉片為測(cè)量單元測(cè)量時(shí)，選擇葉片中間位置為測(cè)量點(diǎn)并避開明顯的葉脈，取3次讀數(shù)平均值。

生物量的測(cè)定：待上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小心地將所有植株挖出并做好標(biāo)記，先用自來(lái)水清洗掉根部土壤，再用雙蒸水清洗3次，分成冠部和根部，置于65 ℃烘箱中烘干48 h至恒重，使用萬(wàn)分之一電子天平測(cè)量冠部干重和根部干重并計(jì)算總干重和根冠比。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定：采用Junior-PAM(Walz,Germany)基礎(chǔ)型調(diào)制熒光儀測(cè)定。首先，將測(cè)量對(duì)象置于暗環(huán)境中適應(yīng)30 min后，測(cè)定最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm)。然后使用人工光源自動(dòng)測(cè)量15次，光照強(qiáng)度為190 μmol/(m2·s)下的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，主要包括電子傳遞效率(ETR)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qL)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)、光系統(tǒng)II(Phtosynthetic system II, PSII)實(shí)際量子產(chǎn)量(ΦPSII)、光誘導(dǎo)的非光化學(xué)淬滅(ΦNPQ)和非光誘導(dǎo)的非光化學(xué)淬滅(ΦNO)。取最后3次讀數(shù)的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示?；贗BM SPSS statistics 23.0 軟件包 (IBM, Chicago, USA)，使用單因素方差分析及Duncan多重比較檢測(cè)不同處理間葉綠素相對(duì)含量、生長(zhǎng)參數(shù)和葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異性，顯著性水平為0.05。使用Origin 8.5進(jìn)行作圖(Origin Lab, USA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 nano-ZnO脅迫對(duì)蕹菜葉綠素相對(duì)含量(SPAD)的影響

圖1為土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜SPAD的影響，其中，n=5，柱頂部小寫字母不同表示有顯著差異，α= 0.05，下同。由圖1可見(jiàn)，土壤中nano-ZnO質(zhì)量比在0 ～20 mg/kg范圍內(nèi)，蕹菜SPAD基本相同，隨著土壤中nano-ZnO質(zhì)量比繼續(xù)升高(>20 mg/kg)，SPAD則迅速持續(xù)下降。當(dāng)土壤中nano-ZnO質(zhì)量比達(dá)到160 mg/kg時(shí)，蕹菜SPAD僅為17.977，相較于對(duì)照組顯著減少了55.63%(F=18.619,p=0.000)。

圖1 土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜SPAD的影響

2.2 nano-ZnO脅迫對(duì)蕹菜生長(zhǎng)參數(shù)的影響

2.2.1 對(duì)生物量和根冠比的影響

圖2(a)(b)(c)(d)為土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜生物量、根冠比、葉片數(shù)量和植株高度的影響，由圖2(a)可見(jiàn)，隨著土壤中nano-ZnO質(zhì)量比的增加，蕹菜的冠部生物量、根部生物量、總生物量均呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)nano-ZnO質(zhì)量比為20 mg/kg時(shí)，冠部生物量、根部生物量、總生物量均達(dá)到最大值，分別為0.299，0.149，0.447 g，較對(duì)照組分別增加了30.10%，28.57%，42.36%，但未達(dá)到顯著性水平。隨著nano-ZnO質(zhì)量比進(jìn)一步升高，3個(gè)指標(biāo)值均逐漸減小。當(dāng)nano-ZnO質(zhì)量比為160 mg/kg時(shí)，冠部生物量(F=2.454,p=0.049)、根部生物量(F=2.780,p=0.030)、總生物量(F=2.600,p=0.039)分別減少至0.165,0.064,0.229 g，與對(duì)照組相比減少了21.05%,39.05%,27.07%，也未達(dá)到顯著水平，但與最高值組相比則差異顯著。由圖2(b)可見(jiàn)，不同nano-ZnO脅迫處理之間根冠比無(wú)顯著差異(F=0.689,p=0.660)。

2.2.2 對(duì)葉片數(shù)量和植株高度的影響

從圖2(c)和(d)可以看出，隨著nano-ZnO質(zhì)量比的增加，蕹菜葉片數(shù)量和植株高度也均表現(xiàn)為先增加后減小的趨勢(shì)。但是只有葉片數(shù)量的增加達(dá)到了顯著水平(F=3.136,p=0.018)，而植株高度的增加并未達(dá)到顯著水平(F=2.137,p=0.080)。當(dāng)nano-ZnO質(zhì)量比為160 mg/kg時(shí)，葉片數(shù)量和植株高度均降至最低值，分別為12.200枚和10.220 cm，均顯著低于最高值組；但與對(duì)照組相比，分別降低了6.01%和10.82%，并未達(dá)到顯著性水平。

圖2 土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜生物量、根冠比、葉片數(shù)量和植株高度的影響

2.3 nano-ZnO脅迫對(duì)蕹菜葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

圖3(a)(b)(c)(d)為土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜Fv/Fm、ETR、qL和NPQ的影響，由圖3可見(jiàn)，F(xiàn)v/Fm與ETR變化趨勢(shì)基本一致。當(dāng)土壤中nano-ZnO質(zhì)量比為0～80 mg/kg時(shí)，不同處理間Fv/Fm與ETR有極小幅度的先增后減變化且未達(dá)到顯著性水平；與對(duì)照組相比，當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到160 mg/kg時(shí)，F(xiàn)v/Fm(F=3.325,p=0.013)與ETR(F=4.001,p=0.005)則顯著降低至0.716和30.723，分別下降了8.32%和23.63%，見(jiàn)圖3(a)(b)。當(dāng)土壤中nano-ZnO質(zhì)量比介于0～80 mg/kg時(shí)，不同處理間的qL無(wú)顯著變化(p>0.05)，NPQ差異也不顯著(p>0.05)；與對(duì)照組相比，當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到160 mg/kg時(shí)，qL(F= 3.732，p=0.034)和NPQ(F=4.281，p=0.015)則分別增加了28.37%和90.56%。

圖3 土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜Fv/Fm、ETR、qL、NPQ的影響

圖4(a)(b)(c)為土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜ΦPSII、ΦNO和ΦNPQ的影響，由圖4可見(jiàn)，當(dāng)土壤中nano-ZnO質(zhì)量比介于0～80 mg/kg時(shí)，不同處理間的ΦPSII和ΦNPQ無(wú)顯著差異。與對(duì)照組相比，當(dāng)土壤中nano-ZnO質(zhì)量比達(dá)到160 mg/kg時(shí)，ΦPSII顯著降低至0.385(F=4.005,p=0.005)，下降了23.38%，見(jiàn)圖4(a)；相反的是ΦNPQ顯著升高至0.260(F=2.680,p=0.035)，上升了41.54%，見(jiàn)圖4(c)。不同處理間非光誘導(dǎo)的非光化學(xué)淬滅(ΦNO)無(wú)顯著差異(F=0.945,p=0.479),見(jiàn)圖4(b)。

圖4 土壤中nano-ZnO對(duì)蕹菜ΦPSII、ΦNO、ΦNPQ的影響

2.4 nano-ZnO質(zhì)量比與蕹菜葉綠素相對(duì)含量、生長(zhǎng)參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的關(guān)系

表1為土壤中nano-ZnO質(zhì)量比與蕹菜生長(zhǎng)參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的相關(guān)性，由表1可見(jiàn)，土壤中nano-ZnO質(zhì)量比與蕹菜葉片葉綠素相對(duì)含量具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)程度高(r=-0.879,p=0.000)；與總生物量、葉片數(shù)等生長(zhǎng)參數(shù)也具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)程度不高；與Fv/Fm、ETR、ΦPSII呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與NPQ、ΦNPQ呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與qL呈顯著正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)程度均不高。

表1 土壤中nano-ZnO質(zhì)量比與蕹菜生長(zhǎng)參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的相關(guān)性(n=35)

2.5 nano-ZnO脅迫對(duì)蕹菜葉綠素相對(duì)含量和生物量累積的影響

Mg2+是高等植物葉片中合成葉綠素大分子的一個(gè)重要元素。葉片中低濃度Zn2+并不會(huì)影響植物生長(zhǎng)，反而對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用[13-14]。然而，當(dāng)葉片中Zn2+濃度過(guò)高時(shí)，它便會(huì)取代Mg2+，破壞葉綠素大分子，最終擾亂植物正常的光合作用和生物量累積[10]。不同植物對(duì)nano-ZnO的生態(tài)響應(yīng)不同。例如，在水培條件下，對(duì)于甜菊(SteviarebaudianaBertoni)而言，≤1 mg/L的nano-ZnO質(zhì)量濃度可對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用，當(dāng)nano-ZnO質(zhì)量濃度>10 mg/L時(shí)則會(huì)抑制甜菊生長(zhǎng)[9]；對(duì)于水稻(OryzasativaL.)而言，當(dāng)nano-ZnO質(zhì)量濃度>50 mg/L時(shí)，才會(huì)顯著抑制水稻葉片葉綠素合成，抑制其生長(zhǎng)[15]。本研究顯示，土壤中nano-ZnO質(zhì)量比與蕹菜葉片葉綠素相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)程度高(r=-0.879,p=0.000)。然而，當(dāng)其質(zhì)量比<40 mg/kg時(shí)，蕹菜葉片葉綠素相對(duì)含量首先呈現(xiàn)出緩慢增加趨勢(shì)，與之相對(duì)應(yīng)的是蕹菜根部生物量、冠部生物量、總生物量、植株葉片數(shù)量、植株高度也均表現(xiàn)出緩慢增加趨勢(shì)，即土壤中低質(zhì)量比氧化鋅可促進(jìn)蕹菜生長(zhǎng)；當(dāng)其質(zhì)量比>40 mg/kg時(shí)，蕹菜葉片葉綠素相對(duì)含量顯著下降，并最終導(dǎo)致蕹菜根部生物量、冠部生物量、總生物量、葉片數(shù)量、植株高度均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，即土壤中高濃度氧化鋅對(duì)蕹菜生長(zhǎng)具有抑制作用，這個(gè)現(xiàn)象和nano-ZnO在酸性條件下極易釋放出Zn2+有關(guān)[5,16]。另外，土壤中nano-ZnO脅迫并未對(duì)蕹菜根冠比產(chǎn)生顯著影響。

2.6 nano-ZnO脅迫對(duì)蕹菜葉片光合能力的影響

Fv/Fm反映了PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率和植物的潛在光合活性[17]。對(duì)于絕大多數(shù)高等植物而言，非脅迫條件下它們的Fv/Fm波動(dòng)幅度極小，即使在輕度脅迫逆境中，該參數(shù)的變化也不大，而只有在中度及以上脅迫條件下該參數(shù)才會(huì)明顯下降[18]。在0～80 mg/kg范圍內(nèi)，蕹菜葉片F(xiàn)v/Fm對(duì)nano-ZnO的響應(yīng)是一個(gè)很緩慢且幅度很小的先升后降的過(guò)程，只有當(dāng)nano-ZnO質(zhì)量比達(dá)到160 mg/kg時(shí)，F(xiàn)v/Fm才顯著下降，這也和ETR顯著降低的結(jié)果相一致。

qL表示植物將分配給PSII反應(yīng)中心的能量用于光合電子傳遞能力，間接反映植物對(duì)光能的轉(zhuǎn)化能力。NPQ表示植物將將分配給PSII反應(yīng)中心但不能用于光合電子傳遞的過(guò)剩能量以熱能形式耗散的能力，是一種植物對(duì)光合機(jī)構(gòu)的自我保護(hù)機(jī)制。ΦNPQ和ΦNO主要用于衡量非光化學(xué)猝滅途徑的能量分配特性。ΦPSII表示PSII反應(yīng)中心部分關(guān)閉時(shí)的實(shí)際原初光能捕獲效率。在不同光照條件下，ΦNPQ、ΦNO、ΦPSII三者間存在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，即ΦNPQ+ΦNO+ΦPSII= 1。

研究表明，土壤中nano-ZnO質(zhì)量比為0～160 mg/kg時(shí)，蕹菜葉片qL對(duì)其響應(yīng)無(wú)明顯規(guī)律。當(dāng)土壤中nano-ZnO質(zhì)量比達(dá)到160 mg/kg時(shí)，蕹菜葉片NPQ、ΦNPQ均顯著升高，但ΦNO無(wú)顯著變化。說(shuō)明該處理?xiàng)l件下，蕹菜植物體內(nèi)PSII反應(yīng)中心失活數(shù)量顯著升高，植物體內(nèi)的激發(fā)能量已過(guò)剩，但過(guò)剩的能量尚可通過(guò)熱能耗散進(jìn)行調(diào)節(jié)，以使反應(yīng)中心免受光傷害。

3 結(jié)論

弱酸性土壤環(huán)境條件下，低質(zhì)量比nano-ZnO (≤ 20 mg/kg) 長(zhǎng)期暴露對(duì)蕹菜生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，高質(zhì)量比nano-ZnO (≥ 40 mg/kg)則具有抑制作用，但對(duì)其生物量分配均無(wú)顯著影響。低質(zhì)量比nano-ZnO (≤ 80 mg/kg) 長(zhǎng)期暴露對(duì)蕹菜葉片光合能力無(wú)顯著影響，高質(zhì)量比nano-ZnO (160 mg/kg)長(zhǎng)期暴露會(huì)導(dǎo)致蕹菜葉片光合能力顯著下降。檢測(cè)蕹菜受nano-ZnO長(zhǎng)期暴露影響程度時(shí)，葉綠素相對(duì)含量和生物量指標(biāo)優(yōu)于弱光誘導(dǎo)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)。