1. 河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001

崗松BaeckeafrutescensL.為桃金娘科崗松屬植物，廣布于東南亞及我國的南部地區(qū)，是重要的香料及藥用植物資源。崗松揮發(fā)油為崗松枝葉經(jīng)水蒸氣蒸餾法制得，為淡黃色至淡棕黃色的澄清液體，具有特殊香味[1]，以其為主要原料的香精產(chǎn)品、防蚊輕工品在市場上頗受青睞[2-3]；此外作為廣西習用中藥收載于《廣西中藥材標準》、廣西壯族自治區(qū)《壯藥質(zhì)量標準》，具有殺蟲止癢、清熱利濕、祛痱、止痛、除濕的功效[4-6]。

網(wǎng)絡藥理學是在系統(tǒng)生物學、多向藥理學和計算機技術(shù)基礎上，以“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡為理念，運用專業(yè)的可視化網(wǎng)絡分析軟件及算法，對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫信息進行虛擬篩選和網(wǎng)絡預測，從而揭示藥物對疾病網(wǎng)絡的干預和影響；其研究的整體性與中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點相吻合，成為解析中藥復雜體系的有利工具[7-9]。目前，崗松油多用于皮膚濕疹、淋病、瘙癢、疥瘡、滴蟲性陰道炎及腳癬的治療，但缺乏較為系統(tǒng)深入的現(xiàn)代藥理研究。本文擬采用網(wǎng)絡藥理學技術(shù)方法，通過分析構(gòu)建“成分-靶標-通路-疾病-組織”網(wǎng)絡，對崗松油藥效組分、藥理作用及其機制進行預測，為崗松油在醫(yī)藥領域的進一步研發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 方法

1.1 崗松揮發(fā)油化學成分及靶蛋白篩選 通過文獻檢索整理崗松揮發(fā)油化學成分，結(jié)合Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.gov/)獲得崗松揮發(fā)油相關化學成分的CAS號及SMILES結(jié)構(gòu)式，借助TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、SEA(http://sea.bkslab.org/)及SwissTargetPrediction(http:// swissTarGetprediction.ch/)等數(shù)據(jù)庫篩選化學成分相關靶蛋白，并導入Cytoscape 3.6.0構(gòu)建崗松揮發(fā)油“成分-靶點”網(wǎng)絡。

1.2 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及關鍵靶標篩選 通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，對崗松油化學成分靶標進行蛋白相互作用(PPI)分析，選擇物種“Homo spaiens”，設定最低相互作用閾值為中等置信度“Medium confidence(0.4)”，并導入Cytoscape 3.6.0構(gòu)建構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖；結(jié)合網(wǎng)絡拓撲分析，選取大于2倍平均度值(degree)的靶標作為關鍵靶標。

1.3 GO分析及KEGG通路富集 利用生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf. gov/，Version 6.8)，對崗松揮發(fā)油關鍵靶標進行GO功能和KEGG通路富集分析，設置標識符為“official gene symbol”，限定物種為“homo sapiens”，并通過R語言將GO、KEGG分析結(jié)果可視化。

1.4 疾病及組織分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對崗松揮發(fā)油關鍵靶標進行疾病、組織富集分析，并導入Cytoscape 3.6.0 構(gòu)建“疾病分析”“組織分布”網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 崗松揮發(fā)油“成分-靶點”網(wǎng)絡 經(jīng)文獻及數(shù)據(jù)庫檢索收集崗松揮發(fā)油化學成分66個(表1)，相關靶蛋白542個；利用Cytoscape 3.6.0構(gòu)建“化學成分-靶點”網(wǎng)絡如圖1所示，該網(wǎng)絡中共有608個節(jié)點，包括成分節(jié)點66個(方形)、靶點節(jié)點542個(圓形)；2863條邊，分別代表“成分-對應靶點”之間的相互關系；節(jié)點大小及顏色深淺與節(jié)點的degree值(網(wǎng)絡中和該節(jié)點相連的節(jié)點數(shù)量)呈正比。其中，20、26、56、36、58、40、31、59、21、43、28、39、10、42、1、17、18、46等18個化合物的degree值較大，提示為崗松揮發(fā)油發(fā)揮藥效的主要活性成分。

表1 崗松揮發(fā)油化合物信息

續(xù)表1表1 崗松揮發(fā)油化合物信息

圖1 崗松揮發(fā)油“化學成分-靶點”網(wǎng)絡圖

2.2 關鍵靶標 通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建542個靶蛋白相互作用關系，并導入Cytoscape 3.6.0中進行可視化處理；以大于平均degree(31.587)的2倍為標準，篩選出符合條件的46個關鍵靶標，結(jié)果如圖2所示。

2.3 GO生物功能與KEGG通路富集分析

2.3.1 GO分析 通過GO分析，共確定了424個GO條目(Pvalue<10-6)：細胞組分(CC)涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)、質(zhì)膜筏、小窩、基地外側(cè)質(zhì)膜等15個條目，分子功能(MF)涉及蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、核受體結(jié)合等23個條目，生物過程(BP)涉及脂多糖相關反應、蛋白質(zhì)定位建立的調(diào)控、細菌源分子相關反應、細胞對有機環(huán)狀化合物的反應、炎癥反應的調(diào)節(jié)等386個相關條目，GO富集結(jié)果如圖3所示。

圖2 關鍵靶蛋白互作網(wǎng)絡圖

圖3 關鍵靶標-GO分析條形圖

2.3.2 KEGG分析 通過KEGG富集分析，共確定了92條相關通路(Pvalue<10-6)，包括癌癥相關通路(癌癥中的蛋白多糖、癌癥通路、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌等)、傳染病相關通路(乙肝、利什曼病、結(jié)核、百日咳等)、信號轉(zhuǎn)導通路(TNF信號通路、HIF-1信號通路等)、內(nèi)分泌和代謝相關通路(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、雌激素信號通路、催乳素信號通路等)等，KEGG通路分析結(jié)果如圖4所示。

2.4 疾病分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行疾病分析，共得到266個相關疾病(Pvalue<10-6，F(xiàn)DR<0.01)，主要涉及多種癌癥疾病(結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等)、婦科疾病(子宮內(nèi)膜異位癥、復發(fā)性妊娠損失、絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥等)、慢性疾病(慢性阻塞性肺疾病、2型糖尿病等)等。結(jié)果如圖5所示。

圖4 關鍵靶標-KEGG通路富集分析

圖5 關鍵靶標-疾病分析結(jié)果

2.5 組織分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行組織分析(Pvalue<0.05)，共得到32個相關組織，包括小腦(正常)、骨髓(BM-CD34+、BM-CD33+)、骨骼肌、扁桃體、頸神經(jīng)節(jié)、唾液腺、肝臟(正常、腫瘤)等組織，結(jié)果如圖6所示。圖中圓形節(jié)點代表關鍵靶標，方形節(jié)點代表組織，節(jié)點顏色深淺與節(jié)點degree值呈正比。

2.6 崗松揮發(fā)油關鍵靶標-作用通路-疾病-組織網(wǎng)絡 將46個關鍵靶標及排名前10的KEGG通路、疾病、組織分析結(jié)果一起導入Cytoscape 3.6.0中構(gòu)建“關鍵靶標-作用通路-疾病-組織”網(wǎng)絡圖，如圖7所示。其中，圓形代表關鍵靶點(46個)，六邊形代表通路(10個)，正方形代表疾病(10個)，菱形代表組織(10個)。

圖6 關鍵靶標-組織分布結(jié)果

圖7 崗松揮發(fā)油關鍵靶標-作用通路-疾病-組織網(wǎng)絡圖

3 討論

揮發(fā)油類為崗松主要化學成分之一，文章基于網(wǎng)絡藥理學分析探討其藥效組分、藥理作用及機制。通過數(shù)據(jù)庫檢索篩選崗松油化學成分66個，對應靶點542個，其中橙花叔醇、龍腦、丁香酚、乙酸橙花酯、香芹酚、α-Cadinol、α-Elemene、乙酸香葉酯、d-檸檬烯、百里香酚、γ-Eudesmol、冰片、芳樟醇等18個化合物在“化學成分-靶點”網(wǎng)絡圖中degree值較大，可作為主要活性成分；通過AKT1、ALB、IL6、MAPK3、TP53、VEGFA、SRC、TNF、CASP3等關鍵靶標，主要參與脂多糖相關反應、蛋白質(zhì)定位建立的調(diào)控、細菌源分子相關反應、炎癥反應等生物過程，作用于包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥中的蛋白多糖通路、內(nèi)分泌抵抗通路、IL-17信號通路在內(nèi)的多種癌癥通路、傳染病通路、信號轉(zhuǎn)導通路、內(nèi)分泌和代謝相關通路等發(fā)揮作用；且疾病分析和組織分布顯示，崗松油主要作用于小腦、骨髓、骨骼肌、扁桃體等組織及器官，可對結(jié)直腸癌、前列腺癌、慢性阻塞性肺疾病、子宮內(nèi)膜異位癥等多種癌癥、慢性疾病、婦科疾病及其他病癥發(fā)揮治療作用。

含崗松油的多為外用制劑，對外治滴蟲性陰道炎、皮膚濕疹、蛇蟲咬傷、燒燙傷等具有抗菌消炎、清潔護膚等作用[10-11]，而對本研究所預測的多種癌癥、慢性疾病及婦科病等尚未有報道；其中糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路表明[12-15]，AGE、RAGE可通過誘導PI3K-Akt依賴的信號途徑激活，進而產(chǎn)生NF-κB活性，促進細胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)、促凋亡相關基因CASP3、細胞增殖導致腎功能不全相關基因CYCD1、及促血管形成相關基因VEGF等的表達，從而誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥；癌癥相關通路表明[16-19]，所篩選的關鍵靶標通過多通路多靶點，對下游多個通路進行整體調(diào)控，如激活cAMP信號通路進而激活PKA、激活PI3K-Akt信號通路進而連續(xù)激活PKB/Akt，使下游相關靶點磷酸化被激活或抑制等，這些作用通路均與癌癥相關；因此，網(wǎng)絡藥理學分析在闡釋傳統(tǒng)藥效機制的同時，也進一步挖掘了崗松油其可能的、潛在的藥理作用。

本研究通過構(gòu)建崗松揮發(fā)油“化學成分-靶標-通路-疾病-組織”網(wǎng)絡，分析探討其發(fā)揮藥理作用的活性成分、作用靶點及通路，為崗松油后續(xù)的系統(tǒng)深入研究提供理論依據(jù)。