王丹陽(yáng), 王予彤,2, 于良斌, 韓海斌, 徐林波,*, 崔艷偉,康愛(ài)國(guó), 龐紅巖

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所, 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 呼和浩特 010020;3.河北省張家口市康?？h植保站, 河北張家口 076650)

線粒體(mitochondrion)是真核生物細(xì)胞中一種重要的胞質(zhì)細(xì)胞器，在細(xì)胞代謝、凋亡、疾病和衰老中起著重要作用(Boore, 1999; Alcolado, 2005; Cameron, 2014)。線粒體基因具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、組成穩(wěn)定、排列保守、母系統(tǒng)遺傳、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育分析、種群遺傳分化等研究中(Boore, 1999; Ballard and Rand, 2005; Weietal., 2010a; 李倩, 2014)。對(duì)于大多數(shù)昆蟲(chóng)而言，線粒體基因組通常是一個(gè)大小為15～20 kb的雙鏈閉合環(huán)狀分子，編碼37個(gè)基因，包括13個(gè)蛋白編碼基因(PCGs)2個(gè)核糖體RNA(rRNA)基因和22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)基因，以及1個(gè)長(zhǎng)的非編碼區(qū)(又稱為控制區(qū)或AT富含區(qū))(Wolstenholme and Clary, 1985; Boore, 1999; Sharkey and Chapman, 2017)。

膜翅目(Hymenoptera)是六足總綱中較為高等的類群，除了具有上述普遍特征外，其線粒體基因組還有重排率較高，基因重排程度在類群間有差異，廣腰亞目(Symphyta)排列較細(xì)腰亞目(Apocrita)保守等特點(diǎn)(魏書(shū)軍, 2009; Weietal., 2014)。繭蜂科(Braconidae)是膜翅目最大的科，已記錄了1 040多個(gè)屬，19 000余種(Wharton and van Achterberg, 2000; Weietal., 2010b; Lietal., 2016)，其中有許多種類是農(nóng)林害蟲(chóng)的重要寄生性天敵。繭蜂科是研究寄生蟲(chóng)模式演變的理想群體，而該家族報(bào)道完整的線粒體基因組較少(李倩, 2014; 宋勝楠, 2015)。而且，繭蜂科昆蟲(chóng)幾乎全部營(yíng)寄生生活(Dangerfield and Austin, 1998)，且寄主范圍極其廣泛，是重要的天敵資源昆蟲(chóng)，對(duì)其深入、全面的研究才能更好地發(fā)揮其利用價(jià)值。

綠眼賽繭蜂Zelechlorophthalmus屬膜翅目(Hymenoptera)繭蜂科(Braconidae)優(yōu)繭蜂亞科(Euphorinae)，主要分布于我國(guó)河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江、浙江、安徽、甘肅、寧夏、新疆等地(何俊華等, 2004)。綠眼賽繭蜂為內(nèi)寄生，是草地螟Loxostegesticticalis、甜菜夜蛾Spodopteraexigua和斜紋夜蛾Spodopteralitura等農(nóng)業(yè)重大害蟲(chóng)的主要天敵(李倩等, 2017)。目前國(guó)內(nèi)僅有少量關(guān)于其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性等方面的研究，尚無(wú)對(duì)綠眼賽繭蜂線粒體基因組全序列的研究報(bào)道(杜芹, 2015; 李倩等, 2017)。雖然繭蜂科線粒體基因組的信息已有報(bào)道，但是并不全面，而且繭蜂科昆蟲(chóng)幾乎全部營(yíng)寄生生活(Dangerfield and Austin, 1998)，且寄主范圍極其廣泛，是重要的天敵資源昆蟲(chóng)，對(duì)其深入、全面的研究才能更好地發(fā)揮其利用價(jià)值。本研究對(duì)綠眼賽繭蜂線粒體全基因組進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)合GenBank中已收錄的21種繭蜂科昆蟲(chóng)的線粒體基因組COX1序列進(jìn)行比較分析，探討繭蜂科各亞科、各屬及種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在為綠眼賽繭蜂的種群遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)以及繭蜂科的分子系統(tǒng)發(fā)育研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

綠眼賽繭蜂成蟲(chóng)于2018年5月采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)試驗(yàn)基地，室內(nèi)以草地螟為寄主，在溫度21～23℃、相對(duì)濕度50%～70%、光周期16L∶8D條件下，以15%蜂蜜水繼代飼養(yǎng)繁育。

1.2 綠眼賽繭蜂總DNA的提取

取單頭成蟲(chóng)用于總DNA提取，采用DNeasy DNA Extraction Kit試劑盒(QIAGEN)，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA的抽提，提取后采用Thermo Scientific NanoDrop 2000檢測(cè)純度及濃度，采用瓊脂糖電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)其完整性。

1.3 序列測(cè)定

采用全基因組鳥(niǎo)槍法(whole genome shotgun, WGS)策略構(gòu)建文庫(kù)，利用第二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)，基于Illumina MiSeq測(cè)序系統(tǒng)，對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行雙末端(paired-end, PE)測(cè)序。

1.4 基因組序列拼裝與注釋

采用A5-miseq v20150522(Coiletal., 2015)和SPAdesv3.9.0(Bankevichetal., 2012)對(duì)高質(zhì)量的二代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼裝，構(gòu)建contig和scaffold序列。根據(jù)拼接序列的測(cè)序深度提取序列，將高測(cè)序深度的序列同NCBI上的nt庫(kù)進(jìn)行blastn(BLAST v2.2.31+)比對(duì)，挑出各拼接結(jié)果的線粒體序列。拼接結(jié)果整合：將以上不同軟件得到的線粒體拼接結(jié)果利用mummer v3.1軟件進(jìn)行共線性分析，確定contig間的位置關(guān)系，進(jìn)行contigs間gap的填補(bǔ)。使用pilon v1.18(Walkeretal., 2014)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正以得到最終的線粒體序列。使用MEGA7.0對(duì)線粒體基因組各部分的堿基組成和相對(duì)同義密碼子使用頻率(relative synonymous codon usage, RSCU)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

將拼接得到的完整的線粒體基因組序列上傳至MITOS網(wǎng)頁(yè)服務(wù)器(http:∥mitos.bioinf.uni-leipzig.de)進(jìn)行功能注釋(Berntetal., 2013)。其中Genetic Code選擇設(shè)置為05-inverterbrate，其余設(shè)置按照MITOS設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)，分別計(jì)算線粒體全基因組、蛋白編碼基因、基因排列順序、rRNA基因的堿基組成等。采用OGDRAM(ogdraw.mpimp-golm.mpg.del)在線可視化軟件繪制線粒體全基因組圈圖(Lohseetal., 2013)。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以蜜蜂科的兩個(gè)種小蜜蜂Apisflorea和大蜜蜂Apisdorsata為外群，選用已報(bào)道的21種繭蜂科昆蟲(chóng)和綠眼賽繭蜂的線粒體基因組COXⅠ基因的核苷酸序列，通過(guò)MEGAX的Align by Clustal-X程序進(jìn)行序列比對(duì)(Kumaretal., 2016)，利用MEGA-X軟件采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)構(gòu)建繭蜂科的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)樹(shù)分支的置信水平用bootstrap test(Felsenstein, 1985)估計(jì)，重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果

2.1 綠眼賽繭蜂線粒體基因組的基因組成

綠眼賽繭蜂線粒體基因組全長(zhǎng)16 661 bp(GenBank登錄號(hào): MG822749)，基因組的基因排布與已報(bào)道繭蜂科其他種類的(Weietal., 2014; Lietal., 2016)相似度高，呈雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1)?；蚪M成包含13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因(rrnS和rrnL)和1個(gè)AT控制區(qū)(CR)。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中有4個(gè)(NAD1,NAD4l,NAD4,NAD5)在N鏈上，其余9個(gè)(Cob,NAD6,NAD3,COX3,ATP6,ATP8,COX2,COX1,NAD2)在J鏈上；22個(gè)tRNA基因中有10個(gè)位于N鏈，12個(gè)位于J鏈上；2個(gè)rRNA基因均位于N鏈上，其中rrnS基因長(zhǎng)748 bp，位于tRNAIle(I)和tRNAVal(V)之間；rrnL基因長(zhǎng)1 264 bp，位于tRNAVal(V)和tRNALeu-1(L1)之間(圖1)；控制區(qū)長(zhǎng)度418 bp，位于tRNAGln(Q)和tRNAMet(M)之間。

圖1 綠眼賽繭蜂線粒體基因組結(jié)構(gòu)

綠眼賽繭蜂線粒體基因組上的基因排列順序與昆蟲(chóng)線粒體原始排列(魏書(shū)軍, 2009; 魏書(shū)軍和陳學(xué)新, 2011)存在一定差異。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和2個(gè)rRNA基因的排列順序和方向均相同，7個(gè)tRNA基因發(fā)生重排。tRNACys(C)從tRNATrp(W)和tRNATyr(Y)之間移到了COX3和tRNAGly(G)之間，tRNAAsn(N)從tRNASer-1(S1)和tRNAArg(R)之間移到了tRNAPhe(F)和NAD5之間，tRNALys(K)和tRNAAsp(D)以及tRNASer-1(S1)和tRNASer-2(S2)發(fā)生了基因位置互換，tRNAIle(I)發(fā)生了倒置，tRNAMet(M)和tRNAGln(Q)發(fā)生了異位倒置。

綠眼賽繭蜂線粒體基因組有16處基因重疊，共107 bp，最長(zhǎng)重疊位于COX1和tRNATyr(Y)之間，重疊序列長(zhǎng)24 bp。基因間隔區(qū)域有18處，共1 886 bp，最長(zhǎng)間隔854 bp，位于tRNASer-2(S2)和Cob之間；其次為NAD1和tRNASer-2(S2)之間，間隔236 bp。既無(wú)重疊又無(wú)間隔有4處(表1)。

表1 綠眼賽繭蜂線粒體基因組特征分析

2.2 綠眼賽繭蜂線粒體基因組核苷酸組成

綠眼賽繭蜂線粒體基因組中，A, T, G和C含量分別為43.00%, 39.84%, 10.09%和7.08%，A含量最高而C含量最低(表2)。全基因組的A+T總量高達(dá)82.83%，G+C含量為17.17%，呈現(xiàn)明顯的A+T偏好性，符合昆蟲(chóng)線粒體基因組中A+T含量偏向性的特征(夏靖等, 2011; 王菊平等, 2015; 鐘健等, 2017)。綠眼賽繭蜂基因組全序列的AT偏斜(AT-skew)為0.038，GC偏斜(GC-skew)為0.176，表明A多于T，G多于C。從不同的基因來(lái)看，蛋白質(zhì)編碼基因的AT偏斜均為負(fù)值，J鏈上9個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的GC偏斜為負(fù)值。N鏈上4個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因的GC偏斜均為正值，與大多數(shù)昆蟲(chóng)的線粒體基因組AT/GC偏斜(彭艷等, 2017)一致。

表2 綠眼賽繭蜂線粒體基因組的核苷酸組成

2.3 綠眼賽繭蜂線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)

綠眼賽繭蜂線粒體蛋白質(zhì)編碼基因長(zhǎng)度與其他膜翅目昆蟲(chóng)線粒體蛋白編碼基因相似，13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因均以ATN為起始密碼子，以TAA為終止密碼子，其中NAD3以ATA為起始密碼子，NAD6,NAD4l,NAD5,ATP8,COX1和NAD2以ATT為起始密碼子，其余6種均以ATG作為起始密碼子。綠眼賽繭蜂線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的相對(duì)同義密碼子使用頻率(RSCU)見(jiàn)表3。綠眼賽繭蜂線粒體蛋白質(zhì)編碼基因?qū)和T有明顯的偏向性，使用最多的5個(gè)密碼子是AAA(Lys)525次、UAA(終止密碼子)465次、UUA(Leu)459次、AAU(Asn)420次和UUU(Phe)394次。只有Met和Trp僅有一種密碼子，分別為AUG和UGG。除了Met和Trp外，綠眼賽繭蜂蛋白質(zhì)編碼基因使用頻率最高密碼子第3位偏好使用A和U，與一些膜翅目昆蟲(chóng)(Fanetal., 2017; 彭艷等, 2017)相似，蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸百分比最高者為Ile(15.3%)，其次為L(zhǎng)eu(13.2%), Lys(11.2%)和Phe(8.6%)。

表3 綠眼賽繭蜂線粒體基因組相對(duì)同義密碼子使用頻率(RSCU)

2.4 綠眼賽繭蜂線粒體基因組tRNA基因和rRNA基因

綠眼賽繭蜂線粒體基因組的22個(gè)tRNA基因與其他膜翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組對(duì)應(yīng)的tRNA反密碼子相同，除tRNALeu和tRNASer有兩個(gè)tRNA結(jié)構(gòu)外，其他都只有一個(gè)與之對(duì)應(yīng)。除tRNAHis(H)缺失TΨC環(huán)和tRNACys(C)僅剩DHU臂和反密碼子臂外，其他tRNA基因都能形成典型的三葉草式二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)。在三葉草結(jié)構(gòu)中還發(fā)現(xiàn)有6處錯(cuò)配：tRNAAla(A)有1處，錯(cuò)配于氨基酸臂上；tRNAPhe(F), tRNAGly(G)和tRNAVal(V)各有1處，位于DHU臂上；tRNAGln(Q)有2處，分別位于DHU臂和反密碼子臂上，發(fā)生錯(cuò)配的堿基均為G-U。

圖2 綠眼賽繭蜂線粒體基因組tRNA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)

綠眼賽繭蜂線粒體基因組的2個(gè)rRNA基因與大部分昆蟲(chóng)線粒體rRNA基因相比類似，具有明顯的AT堿基偏向性，rrnS與rrnL的長(zhǎng)度分別為748 bp和1 264 bp(表1)，A+T的含量分別為85.03%和85.28%(表2)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以蜜蜂科為外群，基于已報(bào)道的21個(gè)繭蜂科種和綠眼賽繭蜂的線粒體基因組COX1蛋白編碼基因序列，采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)利用MEGA-X軟件構(gòu)建繭蜂科的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3和4)。最大似然法分析結(jié)果(圖3)表明，繭蜂科各個(gè)種群分類關(guān)系為蚜繭峰亞科Aphidiinae+(長(zhǎng)體繭蜂亞科Macrocentrinae+毛繭蜂亞科Doryctinae+探繭峰亞科Ichneutinae+(窄徑繭蜂亞科Agathidinae+折脈繭蜂亞科Cardiochilinae))+優(yōu)繭峰亞科Euphorinae；鄰接法分析結(jié)果表明，優(yōu)繭峰亞科Euphorinae+(蚜繭峰亞科Aphidiinae+((窄徑繭蜂亞科Agathidinae+折脈繭蜂亞科Cardiochilinae)+(探繭峰亞科Ichneutinae)+(長(zhǎng)體繭蜂亞科Macrocentrinae+毛繭蜂亞科Doryctinae)))。綜合比較，兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)大致相同。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，繭蜂科主要分為3支，蚜繭峰亞科為一支，優(yōu)繭蜂亞科為一支，剩余的一支包括長(zhǎng)體繭蜂亞科、毛繭蜂亞科、探繭蜂亞科、折脈繭蜂亞科和窄徑繭蜂亞科。窄徑繭蜂亞科(Agathidinae)和折脈繭蜂亞科(Cardiochilinae)在兩種方法中都為姐妹群。綠眼賽繭蜂聚于優(yōu)繭蜂亞科賽繭蜂屬，與傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)結(jié)果一致，其與雪跗賽繭蜂Zeleniveitarsis親緣關(guān)系較近。

圖3 最大似然法構(gòu)建的基于線粒體COX1序列的繭蜂科22個(gè)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1 000次重復(fù))

圖4 鄰接法構(gòu)建的基于線粒體COX1序列的繭蜂科22個(gè)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1 000次重復(fù))

3 討論

亞庫(kù)巴果蠅Drosophilayakuba線粒體基因組的排列方式被認(rèn)為是昆蟲(chóng)線粒體基因組最原始的排列方式(魏書(shū)軍和陳學(xué)新, 2011)，綠眼賽繭蜂線粒體基因組與其相比，存在基因重排現(xiàn)象。本研究通過(guò)與繭蜂科其他種的線粒體基因組比較分析，發(fā)現(xiàn)綠眼賽繭蜂線粒體基因組重排多出現(xiàn)于tRNA基因中，除tRNALeu-2(L2)處于COX1和COX2之間較穩(wěn)定，沒(méi)有出現(xiàn)重排外，其余tRNA基因都曾出現(xiàn)重排現(xiàn)象。膜翅目分為廣腰亞目(Symphyta)和細(xì)腰亞目(Apocrita)兩個(gè)類群，廣腰亞目的基因排列相比細(xì)腰亞目保守，重排較少(宋勝楠, 2015)，但細(xì)腰亞目存在大量重排，包括移位、原位倒置、異位倒置(Weietal., 2010b)，而綠眼賽繭蜂屬于細(xì)腰亞目。膜翅目線粒體具有較高的重排速率，主要集中發(fā)生于AT富含區(qū)NAD2,NAD2-COX1,COX2-ATP8和NAD3-NAD5區(qū)(魏書(shū)軍, 2009)。

膜翅目繭蜂科昆蟲(chóng)線粒體基因組中有大量的基因間隔區(qū)和基因重疊區(qū)的現(xiàn)象并不少見(jiàn)。離顎細(xì)蜂科的Vanhorniaeucnemidaru存在36處基因間隔，5處基因重疊，基因間隔總長(zhǎng)達(dá)1 777 bp，基因重疊共31 bp(Castroetal, 2006)；蓋拉頭甲腫腿蜂Cephalonomiagallicola基因間隔總長(zhǎng)度比綠眼賽繭蜂基因間隔長(zhǎng)，共有22處，長(zhǎng)2 543 bp，基因重疊4處，共36 bp(魏書(shū)軍, 2009)；半閉彎尾姬蜂Diadegmasemiclausum也有13處基因間隔，共1 846 bp，14處基因重疊，共61 bp(魏書(shū)軍, 2009)。比較發(fā)現(xiàn)，基因重排發(fā)生的區(qū)域基因間隔較大，而基因重疊區(qū)基因重排發(fā)生較少。繭蜂科昆蟲(chóng)常有一些較短的基因間隔區(qū)，但也存在例外，綠眼賽繭蜂有兩處較長(zhǎng)的基因間隔，NAD1與tRNASer-2(S2)之間有236 bp的基因間隔，tRNASer-2(S2)與Cob之間有854 bp的基因間隔，推斷是由于tRNASer-2(S2)和tRNASer-1(S1)發(fā)生了位置互換產(chǎn)生的。發(fā)生重排的基因左右都有較大的基因間隔區(qū)，因此推斷基因間隔可能是昆蟲(chóng)線粒體基因組產(chǎn)生重排的原因，具體原因還需要更進(jìn)一步的研究。

通過(guò)不同方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，綜合分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)繭蜂亞科和蚜繭峰亞科的單系性得到很高的支持。窄徑繭蜂亞科和折脈繭蜂亞科互為姐妹群。寬鞘繭蜂屬Centistes、瓢蟲(chóng)繭蜂屬Dinocampus和賽繭蜂屬Zele同屬于優(yōu)繭蜂亞科(Euphorinae)，這與傳統(tǒng)分類方法的結(jié)果(陳學(xué)新等, 2000)一致，但寬鞘繭蜂的兩個(gè)種并沒(méi)有聚到一起，還需要進(jìn)一步研究。兩種方法都將窄徑繭蜂亞科、折脈繭蜂亞科、探繭蜂亞科、長(zhǎng)體繭蜂亞科和毛繭蜂亞科聚于一支，說(shuō)明這5種亞科之間的親緣關(guān)系較近，而與優(yōu)繭蜂亞科和蚜繭峰亞科關(guān)系較遠(yuǎn)。

本研究對(duì)綠眼賽繭蜂線粒體基因組全序列的測(cè)定豐富了繭蜂科線粒體基因組的序列信息，為分子進(jìn)化信息系統(tǒng)增添了有益的數(shù)據(jù)信息，并且為線粒體基因的結(jié)構(gòu)和組成提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后續(xù)繭蜂科系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系奠定基礎(chǔ)。