羅欣劍， 孔曉英， 車昊昱， 邢 濤， 甄 峰，6， 孫永明

（1.中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640； 2.中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3. 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510640； 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京100049； 5.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062； 6.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030）

0 引言

秸稈是我國(guó)豐富的生物質(zhì)資源之一，若處置不當(dāng)，如采用傳統(tǒng)的焚燒處理，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，從而危害人體健康。 干式厭氧發(fā)酵技術(shù)（發(fā)酵原料的TS 含量大于15%）能同時(shí)實(shí)現(xiàn)秸稈的生態(tài)循環(huán)利用和能量轉(zhuǎn)化，具有原料適用范圍廣、沼液產(chǎn)生少等特點(diǎn)，得到了各國(guó)的廣泛關(guān)注和研 究[1]，[2]。

目前，微氧處理在秸稈濕式厭氧發(fā)酵過程中已有研究，但所得結(jié)果具有爭(zhēng)議。 有研究表明，向發(fā)酵體系通入適量氧氣能增強(qiáng)原料的水解作用，提高甲烷產(chǎn)量，減少有毒代謝物（如乳酸和乙醇）的形成，提高纖維素酶和蛋白酶水解酶的活性[3]。Fu S F 的研究表明，在微氧濃度為5 mL/g 的條件下對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理后，濕式厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣過程中的產(chǎn)甲烷率最高，比對(duì)照組提高了16.24%[4]。Tsapekos P 的研究表明， 在微氧濃度為5 mL/g 的條件下對(duì)麥稈進(jìn)行預(yù)處理后，濕式厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣率最高，比對(duì)照組提高了7.2%，且確定了微氧濃度的臨界閾值為10 mL/g[5]。 Pedizzi C 的研究表明，以玉米飼料和豬糞為原料，當(dāng)微氧濃度為4.3，8.8 mL/g 時(shí)， 濕式厭氧發(fā)酵過程中甲烷的生成率均下降了40%，并且在8.8 mL/g 的微氧濃度下，古菌群落發(fā)育較慢， 這表明微氧環(huán)境也可能對(duì)產(chǎn)甲烷菌的活性產(chǎn)生負(fù)面影響[6]。

本文擬采用微氧-厭氧發(fā)酵工藝，即在厭氧發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)構(gòu)建不同的微氧環(huán)境， 直接進(jìn)行高溫干式厭氧發(fā)酵試驗(yàn)。 通過監(jiān)測(cè)累積產(chǎn)甲烷量、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）濃度、pH 值和原料固體降解率等參數(shù)，考察玉米秸稈在微氧-厭氧干式發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣特性。 同時(shí)，根據(jù)不同發(fā)酵時(shí)間，取樣并進(jìn)行宏基因組分析，研究微氧-厭氧干式發(fā)酵過程中細(xì)菌和古菌的分布與變化，以探究微生物的演變規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈取自遼寧省營(yíng)口市， 風(fēng)干粉碎后過40 目篩備用。接種物取自本實(shí)驗(yàn)室正常運(yùn)行的高溫連續(xù)攪拌厭氧反應(yīng)器 （Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR），試驗(yàn)前饑餓培養(yǎng)一周。 試驗(yàn)原料及接種物的特性如表1 所示。

表1 試驗(yàn)原料及接種物的特性Table 1 Properties of feedstock and inoculum

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)使用有效容積為500 mL 的發(fā)酵瓶，設(shè)置發(fā)酵固體（以TS 計(jì)）濃度為16.5%，底物有機(jī)負(fù)荷為170.5 g/L， 添加0.74±0.01 g 尿素以調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的C/N 為25。 所有物料加入后從反應(yīng)器頂端通3 min 氮?dú)庖耘懦諝?，再用針筒分別注入定量純氧，形成不同的微氧濃度。 各試驗(yàn)組的設(shè)計(jì)見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 The design of experiment

取兩個(gè)發(fā)酵瓶分別添加130 mL 接種物，記錄其產(chǎn)氣，以扣除試驗(yàn)過程中接種物的產(chǎn)氣。 將密閉的發(fā)酵瓶置于55±1 ℃的恒溫水浴鍋中，試驗(yàn)期間每天早晚各手動(dòng)震蕩1 次，當(dāng)日產(chǎn)氣量低于總產(chǎn)氣量的1%時(shí)，停止試驗(yàn)（每組試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行樣）。 所有產(chǎn)氣數(shù)據(jù)和微氧濃度均以VS 計(jì)。為分析干式厭氧發(fā)酵過程中細(xì)菌和古菌的群落演替規(guī)律，每組選取兩個(gè)平行發(fā)酵瓶，在發(fā)酵的第2，6，10，14，19，27 天在發(fā)酵瓶底端取樣孔 處取樣， 將D-1 組的樣品分別標(biāo)記為D-1-2，D-1-6，D-1-10，D-1-14，D-1-19，D-1-27，以此類推。 樣品保存在-20 ℃冰箱內(nèi)以待分析。

1.3 測(cè)試和分析方法

根據(jù)APHA 標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定TS 和VS 含量；采用Vario EL cube 元素分析儀 （德國(guó)Elementar 公司）測(cè)定C，H，N 和O 元素含量；采用雷磁pHS-3C 型pH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠）測(cè)定pH 值；采用Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）測(cè)定VFAs 濃度；采用島津GC 2014 型高效氣相色譜測(cè)定CH4和CO2等氣體的含量。

累積產(chǎn)氣率（mL/g） 和累積產(chǎn)甲烷率（mL/g）（以單位質(zhì)量的VS 計(jì)）的計(jì)算式為

式中：VSd為降解后原料的固體含量，%；VSf為降解前原料的固體含量，%。

委托生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析。首先進(jìn)行DNA 提取和擴(kuò) 增， 使 用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA 的試劑盒提取DNA， 再用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 的完整性； 利用Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA 精確定量， 以確定PCR 反應(yīng)加入的DNA 量。古菌使用槽式PCR 擴(kuò)增三輪，第一輪使用M-340F （5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3'），GU1ST-1000R（5'-GGCCATGCACYWCYTCT C-3'）引物擴(kuò)增；第二輪使用第一輪PCR 產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 所用的引物為融合了Miseq 測(cè)序平臺(tái)的V3-V4 通用引物：349F[5'-CCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGM GAAW-3']引物和806R（5'-GACTGGAGTTCCTT GGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATC TAAT-3'）引物；然后，引入Illumina 橋式PCR 兼容引物，進(jìn)行第三輪擴(kuò)增。細(xì)菌則在第一輪中使用引物341F[5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3']， 第兩輪PCR 擴(kuò)增使用引物805R（5'-GACTGGAGTTCCT TGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC3'）， 然后， 在第三輪使用Illumina 橋式PCR 兼容引物擴(kuò)增。

進(jìn)行DNA 純化回收后，定量混合樣品，每個(gè)樣品的DNA 量取10 ng， 使得最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。 測(cè)序在Illumina HiSeq 2000（Illumina，San Diego，USA）上進(jìn)行。 最后數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后再分別進(jìn)行OUT 聚類分析和生物多樣性分析，利用RDP 分類器將獲得的序列依次分為域、門、綱、目、科、屬6 個(gè)水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 干式厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣性能

玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵期間的累積產(chǎn)氣率和累積產(chǎn)甲烷率的變化情況如圖1 所示。

圖1 累積產(chǎn)氣率和累積產(chǎn)甲烷率的變化情況Fig.1 Cumulative gas production and cumulative methanogenic during dry anaerobic digestion

從圖1 可以看出：D-1 組 （微氧濃度為0.45 mL/g）的累積產(chǎn)甲烷率最高，為134.27±18.71 mL/g，比D-K 組（對(duì)照組）提高了8.11%；D-5 組（微氧濃度為4.51 mL/g）的累積產(chǎn)甲烷率最低，較D-K組降低了55.41%。當(dāng)微氧濃度為0.45 mL/g 時(shí)，可提高玉米秸稈厭氧發(fā)酵的累積產(chǎn)甲烷率， 微氧濃度為1.13～4.51 mL/g 時(shí)， 累積產(chǎn)甲烷率隨著微氧濃度的提升而降低， 這可能是當(dāng)氧氣濃度超過一定范圍時(shí)， 厭氧產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)受到抑制而影響了產(chǎn)氣效果，這與付善飛的研究結(jié)論相一致[7]。

玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣情況如表3 所示。 由表3 可知：D-1 組的平均甲烷濃度為54.12%，較D-K 組提升了8.92%；當(dāng)微氧濃度為1.13～4.51 mL/g 時(shí)， 各試驗(yàn)組的平均甲烷濃度較D-K 組大幅度降低， 其中，D-5 組的平均甲烷濃度最低，僅為39.63%，較D-K 組降低了20.24%。這可能與好氧細(xì)菌的增殖生成了更多的CO2，以及產(chǎn)甲烷菌豐度降低有關(guān)[8]。 隨著微氧濃度的增大，干式厭氧發(fā)酵的固體降解率隨之增高，較DK 組提升了19.35%～46.07%。 各試驗(yàn)組的有效產(chǎn)氣時(shí)間T80（累積產(chǎn)甲烷率到達(dá)理論產(chǎn)甲烷率的80%所用的時(shí)間）為17 ～22 d，其中，D-1，D-2 和D-5 組的T80較D-K 組延后了1 d，D-3 和D-4組的T80較D-K 組延后了4 d， 即當(dāng)微氧濃度為2.26～3.38 mL/g 時(shí)， 玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵過程的T80明顯延長(zhǎng)。

表3 干式厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣情況Table 3 Gas production performance of dry anaerobic digestion

2.2 VFAs 濃度和pH 值的變化規(guī)律

整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)VFAs 濃度的變化規(guī)律如圖2 所示。 從圖2 可以看出：在第2 天，各試驗(yàn)組的VFAs 濃度均比D-K 組低， 這是因?yàn)檠鯕獾奶砑訙p緩了VFAs 的生成速率并避免其快速積累；在第6 天， 僅有D-2，D-5 和D-K 組表現(xiàn)出VFAs濃度的降低， 其余組則表現(xiàn)出VFAs 濃度滯后降低的現(xiàn)象；在第10～19 天，各試驗(yàn)組的VFAs 濃度急劇積累，并在第19 天達(dá)到峰值；D-3 和D-4 組的VFAs 濃度在第19 天達(dá)到峰值后，又很快消耗至較低水平，其余試驗(yàn)組只消耗了一半的VFAs， 大量VFAs 仍停留在發(fā)酵體系中未被利用[9]。

圖2 發(fā)酵周期內(nèi)VFAs 濃度的變化規(guī)律Fig.2 Variation of total volatile fatty acids during dry anaerobic digestion

干式厭氧發(fā)酵過程中VFAs 濃度的變化情況見表4。 由表4 可以看出：從第10 天開始，所有試驗(yàn)組的丁酸濃度均占VFAs 濃度的90%以上，這與Lim J W 在試驗(yàn)過程中觀察到的現(xiàn)象相一致[10]。乙酸僅在發(fā)酵的前6 天被檢測(cè)到，第2 天各試驗(yàn)組的平均乙酸濃度為5 409 mg/L； 在第19天，除D-4 組外，其余試驗(yàn)組的丁酸濃度均大于9 200 mg/L，出現(xiàn)明顯的丁酸累積現(xiàn)象。

表4 干式厭氧發(fā)酵過程中VFAs 濃度的變化情況Table 4 Variation of VFAs concentration during dry anaerobic digestion mg/L

pH 值是反映厭氧微生物生存環(huán)境的重要指標(biāo)。 高溫厭氧發(fā)酵過程中，底物的水解速率較快，因而容易造成VFAs 的快速積累，發(fā)酵液的pH 值也隨之急劇下降[11]。 干式厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值的變化情況如圖3 所示。 從圖3 可以看出：在前6 d ，乙酸迅速被消耗的過程中，所有試驗(yàn)組發(fā)酵液的pH 值未出現(xiàn)較大波動(dòng)； 在第10～19 天丁酸積累的過程中， 所有試驗(yàn)組發(fā)酵液的pH 值略有降低，但始終保持在正常水平。

圖3 干式厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值的變化規(guī)律Fig.3 Variation of pH value of fermentation broth during dry anaerobic digestion

2.3 微氧-厭氧干式發(fā)酵過程中微生物群落演替規(guī)律

2.3.1 細(xì)菌/古菌群落生物多樣性

以產(chǎn)氣性能為參考， 分別選取D-K，D-1 和D-4 組在第2，6，10，14，19，27 天取樣的測(cè)試結(jié)果，分析在完全厭氧環(huán)境、低微氧環(huán)境和高微氧環(huán)境下，玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵過程中微生物群落的演替規(guī)律。 經(jīng)過宏基因組測(cè)序分析，每個(gè)樣品的多樣性分析指數(shù)如表5 所示。各樣品的覆蓋率均大于0.99，表明大多數(shù)的細(xì)菌被大概率的檢測(cè)到， 即測(cè)試結(jié)果能代表樣品的真實(shí)情況。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均是用來估算樣品中微生物多樣性的，Shannon 指數(shù)越大，說明群落的多樣性越高，Simpson 指數(shù)越大，說明群落的多樣性越低；Chao1 指數(shù)可以估計(jì)物種總數(shù)。 在整個(gè)厭氧發(fā)酵周期內(nèi)，微氧組（D-1 和D-4）的細(xì)菌和古菌群落的多樣性均高于對(duì)照組（D-K），表明在微氧環(huán)境中，發(fā)酵體系的生物多樣性得到了提升；在前14 d，D-4 組的細(xì)菌群落多樣性高于D-1 組，表明高微氧濃度更有利于細(xì)菌群落的多樣性；在第6～14 天，3 個(gè)試驗(yàn)組的古菌多樣性呈現(xiàn)出先急劇提升后又急劇下降的現(xiàn)象，推測(cè)是產(chǎn)甲烷代謝途徑的變化導(dǎo)致古菌群落結(jié)構(gòu)的變化。在整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中，3 個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)菌多樣性均呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)，而古菌多樣性則呈現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)。

表5 不同樣品的細(xì)菌和古菌多樣性指數(shù)分析Table 5 Analysis on bacterial and archaeal diversity index of different samples

2.3.2 細(xì)菌群落演替規(guī)律

各試驗(yàn)組的細(xì)菌群落在門水平的分布如圖4所示。 從圖4 可以看出：D-K 組中僅存在11 種相對(duì)豐度高于1%的門水平物種，遠(yuǎn)低于D-1 和D-4 組的20 種； 相較于D-K 組，D-1 和D-4 組的Proteobacteria 和Bacteroidetes 在第2，6 天顯示出更高的相對(duì)豐度； 第10 天，D-1 和D-4 組 的Proteobacteria的相對(duì)豐度分別快速提升到54%和49%，Chloroflexi 的相對(duì)豐度分別快速提升到6%和27.82%；在第10 天之后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，3 個(gè)試驗(yàn)組均表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，即Firmicutes 的 相 對(duì) 豐 度 上 升，Proteobacteria 和Bacteroidetes 的相對(duì)豐度緩慢下降。 D-1 和D-4組與D-K 組在門水平的差別主要體現(xiàn)在Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes 和Chloroflexi 的變化。

圖4 不同微氧環(huán)境下細(xì)菌群落在門水平上的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of Bacteria community at phylum level in different micro-aerobic environments

各試驗(yàn)組的細(xì)菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度如圖5 所示。 從圖5 可以看出：在D-K 組中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，Clostridium III 的相對(duì)豐度 逐 漸 由 33% 降 至 13% ； 在 前 10 d，Defluviitalea 的相對(duì)豐度由17%逐漸降至2%，而Solibacillus 的相對(duì)豐度則在第10 天急劇升至7%。Clostridium III，Defluviitalea 和Petrimonas是D-K 組的主要水解菌屬，其協(xié)同作用對(duì)纖維素的降解有促進(jìn)作用[12]。

從圖5 還可以看出：在D-1 組中，前6 d 的主 要 菌 屬 為 Clostridium III，Defluviitalea 和Petrimonas， 其相對(duì)豐度在第6 天分別達(dá)到了9%，20%和14%；在第10 天，3 種主要菌屬的相對(duì)豐度均急劇降低至4%以下，而Acinetobacter的相對(duì)豐度則急劇上升至45%，Levilinea 的相對(duì)豐度也提升至3%。 Acinetobacter 是嗜熱厭氧環(huán)境中的主要菌群， 在糖分的分解過程中發(fā)揮作用， 并能夠利用酚等苯環(huán)結(jié)構(gòu)物質(zhì)，Acinetobacter 的突然增加與有機(jī)質(zhì)的快速降解密切相關(guān)。在第14 天之后，Clostridium III 和Petrimonas 為主要菌屬。Clostridium III 是Firmicutes 中的主要菌屬，能將復(fù)雜大分子轉(zhuǎn)化為醇、氫、二氧化碳和揮發(fā)性脂肪酸。 Ziganshin A M 的研究表明，Clostridium III 過多則預(yù)示著發(fā)酵反應(yīng)體系的酸敗[13]。于佳動(dòng)的研究表明，Clostridium III 相對(duì)豐度的升高不利于甲烷的生產(chǎn)[14]。 而在第10天檢測(cè)到的Clostridium III 的相對(duì)豐度急劇減小，且其相對(duì)豐度始終低于其他試驗(yàn)組，對(duì)應(yīng)了D-1 組最高的產(chǎn)甲烷率。 Clostridium III 的變化可能是影響厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷性能的原因之一。

圖5 不同微氧環(huán)境下細(xì)菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of Bacteria community at genus level in different micro-aerobic environments

從圖5 還可以看出：在D-4 組中，前6 d 的主要 菌 屬 為 Clostridium III，Defluviitalea，Petri -monas 和Tepidimicrobium，其相對(duì)豐度在第6 天分別達(dá)到了19%，10%，5%和7%； 在第10 天，4 種主要菌屬的相對(duì)豐度均急劇降低至1%以下，而Acinetobacter 和Levilinea 的相對(duì)豐度分別急劇上升至28%和12%； 在第14 天之后， 僅剩Clostridium III 為主要的菌屬。 Levilinea 和Petrimonas 分別是Chloroflexi 和Bacteroidetes 中的主要菌屬，都能加強(qiáng)碳水化合物轉(zhuǎn)化為乙酸鹽和氫氣的能力[15]。

微氧組與對(duì)照組在細(xì)菌屬水平的主要變化體 現(xiàn) 在 Clostridium III，Defluviitalea，Acineto -bacter，Petrimonas 和Levilinea 5 種 菌 屬，其 協(xié) 同作用使得微氧處理組較對(duì)照組有更高的水解作用效果， 這與微氧試驗(yàn)組得到較高的固體降解率相對(duì)應(yīng)。另外，在3 個(gè)試驗(yàn)組均觀察到能降解丁酸并且耐受氨的Syntrophomonas，其相對(duì)豐度在第14 天最高， 但僅為2%， 未能有效地降解丁酸，這與試驗(yàn)中丁酸的積累相對(duì)應(yīng)?？梢赃M(jìn)一步研究在玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵過程中添加Syntrophomonas 對(duì)緩解丁酸抑制的作用。

2.3.3 古菌群落演替規(guī)律

各試驗(yàn)組的古菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度如圖6 所示。

圖6 不同微氧環(huán)境下古菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of Archaeal community at genus level in different micro-aerobic environments

從圖6 可以看出： 在D-K 組中，Methanobacterium 在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)都屬于主要菌屬，隨著厭氧發(fā)酵的進(jìn)行，其相對(duì)豐度由97%逐漸降至64%； 與此同時(shí)，Methanomassiliicoccus 的相對(duì)豐度由0.2%逐漸升至21%。 Methanobacterium 是有機(jī)物厭氧處理過程中常見的氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌屬，它能利用H2，CO2和甲酸產(chǎn)生甲烷[16]。 Methanomassiliicoccus 下僅有一個(gè)種， 即為Methanomassiliicoccus luminyensis， 它 能 利 用H2，CH3OH生長(zhǎng)并產(chǎn)生甲烷[17]。 因此，在D-K 組中，氫營(yíng)養(yǎng)型代謝過程是主要的甲烷產(chǎn)生途徑。

從圖6 還可以看出：在D-1 組中，在第6～10天，Methanobacterium 的相對(duì)豐度由92%急劇降至20%；與此同時(shí)，Methanothrix 的相對(duì)豐度由2%迅速升至50%； 在第14 天，Methanobacterium 的相對(duì)豐度又由20%迅速升至86%，Methanothrix的相對(duì)豐度由50%迅速降至3%。 Methanothrix 是厭氧發(fā)酵過程中分解乙酸的主要產(chǎn)甲烷菌，并且不利用H2，CO2和甲酸鹽[18]。 因此，在第6～14 天，D-1 和D-4 組可能主要進(jìn)行乙酸型代謝產(chǎn)甲烷途徑。 在這個(gè)階段，兩種代謝途徑的菌屬共同作用，生物多樣性也最大，與多樣性分析相一致。

從圖6 還可以看出：在D-4 組中，在第6～14天，Methanobacterium 和Methanothrix 的相對(duì)豐度具有在D-1 組中相同的變化趨勢(shì)； 不同的是，在第10 天，Methanobacterium 的相對(duì)豐度降至2%，降幅更大， 且Methanothrix 的相對(duì)豐度急劇升至52%，與D-1 組中的變化趨勢(shì)相同，而D-4 組的有效產(chǎn)氣時(shí)間更長(zhǎng)，這可能與不同主要產(chǎn)甲烷途徑菌屬的轉(zhuǎn)變有關(guān)；在第16 天，Methanothrix 的相對(duì)豐度降至18%，降幅較D-1 組更小。 Li W W 認(rèn)為Methanothrix 和Methanomassiliicoccus 促進(jìn)了纖維素類原料降解的程度并有助于甲烷的生成，這也與微氧處理組較對(duì)照組有更高的固體降解率相一致[19]。

總體而言， 在整個(gè)厭氧發(fā)酵周期內(nèi)，D-K 組的優(yōu)勢(shì)菌屬為Methanobacterium 和Methanomassiliicoccus， 主要進(jìn)行氫營(yíng)養(yǎng)型代謝產(chǎn)甲烷途徑。 而微氧試驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌屬較D-K 組多出了Methanothrix。 Methanothrix 是乙酸型代謝產(chǎn)甲烷途徑的主要菌屬。在干式厭氧發(fā)酵過程中，微氧環(huán)境改變了發(fā)酵體系中兩種主要產(chǎn)甲烷代謝途徑菌屬的相對(duì)豐度。

3 結(jié)論

①當(dāng)微氧濃度為0.45 mL/g 時(shí)，厭氧發(fā)酵獲得了最大的累積產(chǎn)氣率和累積產(chǎn)甲烷率， 分別為244.19±25.53，134.27±18.71 mL/g， 較對(duì)照組分別提高了3.40%和8.11%。

②在整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中， 細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)， 而古菌群落多樣性呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)；在微氧環(huán)境下，Clostridium III，Defluviitalea，Acinetobacter，Petrimonas 和Levilinea 是細(xì)菌屬水平的主要菌屬，Methanobacterium，Methanomassiliicoccus 和Methanothrix 是古菌屬水平的主要菌屬， 主要菌屬的協(xié)同作用使得微氧處理組較對(duì)照組有更高的水解作用效果和更高的固體降解率。

③在第6～14 天，微氧試驗(yàn)組的Acinetobacter菌屬（細(xì)菌）和Methanothrix 菌屬（古菌）的相對(duì)豐度均出現(xiàn)急劇增加的現(xiàn)象； 微氧試驗(yàn)組的主要菌屬包含了氫營(yíng)養(yǎng)型和乙酸型代謝產(chǎn)甲烷途徑的菌屬，而對(duì)照組的主要菌屬僅為氫營(yíng)養(yǎng)型代謝產(chǎn)甲烷途徑的菌屬。