高坡，江海龍，靳磊，王琦*

1安徽醫(yī)科大學空軍臨床學院急診科，北京 100142；2空軍特色醫(yī)學中心急診科，北京 100142

脊髓損傷(spinal cord injure，SCI)可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，前者由機械性外力引起，后者由炎癥、缺氧、局部缺血、脫髓鞘等引起，可進一步造成神經細胞死亡，從而引發(fā)感覺及運動功能障礙、神經源性膀胱及腸道功能障礙、性功能障礙等后遺癥，嚴重限制患者的社交活動并降低其生活質量。有調查顯示，和平時期SCI發(fā)病率為(15～39)/100萬，其中頸部損傷約占60%[1]。SCI的具體治療方式及時機尚存在爭議，現有證據建議進展性損傷應盡早行手術治療，可將傷員通過航空醫(yī)療救援迅速轉運至具備手術條件的高級醫(yī)療場所。航空轉運中，低氣壓、震動、加速度、噪音等環(huán)境均會對患者造成一定的影響，但最終會造成何種影響目前尚無明確結論。長距離飛行所使用的固定翼飛機艙內壓力一般維持在海拔2000～3000 m水平，較海平面低約30%，飛行時間多在1～3 h[2]。本研究探索航空轉運中低壓低氧環(huán)境對C5脊髓損傷大鼠呼吸及運動功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 DWDYC2013-Ⅰ型動物低壓艙(空軍航空醫(yī)學研究所)；ABL90FLEX血氣分析儀[雷度米特醫(yī)療設備(上海)有限公司]；ADVIA2120i血細胞分析儀[西門子(中國)有限公司]；LeicaDM3000顯微鏡及成像系統(tǒng)[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿易有限公司]；HE染色制片系統(tǒng)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠20只，體重200～220 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[動物許可證號：SCXK(京)2019-0008]。適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數字表法分為假手術組(n=4)、脊髓損傷組(n=8)與脊髓損傷+低壓組(n=8)。實驗動物的相關方案通過實驗動物倫理委員會批準。

1.3 第五頸髓損傷大鼠模型制備 采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，使用有齒鑷鉗夾大鼠后頸部皮膚觀察是否存在應激性反應以評估麻醉效果，如麻醉效果不滿意，以10%為梯度逐步追加麻醉劑量。

將大鼠俯臥位固定于動物恒溫手術臺，觸摸定位第二頸椎(C2)及第一胸椎(T1)棘突，用左手大拇指與無名指在大鼠枕骨后方固定頭顱，食指與中指在中線兩側固定頸部皮膚，使用手術刀于C2-T1之間沿中線做縱行切口，切開后頸部皮膚。食指向下觸摸頸椎棘突，在棘突正上方使用手術刀劃開筋膜等皮下軟組織，暴露頸后的肌肉，將襯墊置于大鼠T1前下方，使頸椎后曲。使用血管鉗于頸椎棘突正上方向下鈍性分離軟組織至椎骨。使用彎頭血管鉗固定T1棘突，向上提拉保證頸椎后屈，使用手術刀由棘突兩側向外刮除椎板上附著的軟組織，以暴露椎板及椎間韌帶，由T1棘突處向上計數定位C5。

提拉T1棘突，保證頸椎極度后曲，增加椎管骨縫寬度，使用拉鉤向兩側打開固定手術視野，使用手術刀刀尖離斷骨縫間軟組織，使用血管鉗鉗除椎板即可顯露脊髓。采用接觸面積為2.5 mm2的金屬棒迅速壓迫脊髓，持續(xù)1 s。大鼠出現四肢抽動、擺尾即造模成功。逐層縫合切口并再次消毒，置于保溫墊上復溫。

1.4 頸動脈插管 麻醉后沿氣管右側剪開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露右側頸動脈并分離血管。使用彎頭無齒眼科鑷將頸動脈懸空抬起，采用7-0絲線結扎血管遠心端，使用活結結扎近心端，在遠心端用微型剪在血管上剪V形口，使用眼科鑷將PE管向心方向插入頸動脈2～2.5 cm，打開近心端活結，結扎固定頸動脈及PE管鏈接處，用鑷子將PE管引導至頸背部并縫合創(chuàng)口。

1.5 低壓處理 造模后24 h將脊髓損傷+低壓組大鼠置入低壓艙，低壓艙內壓力以10 m/s速度降至預定的海拔2500 m水平，持續(xù)4 h。完成后艙內壓力以10 m/s速度升至常壓水平完成低壓處理。

1.6 觀察指標

1.6.1 動脈血氣指標檢測 將大鼠轉出低壓艙置于恒溫手術臺，使用注射器經頸動脈插管抽取1ml動脈血進行動脈血氣分析，包括pH、氧分壓(partial pressure of oxygen，PaO2)、氧飽和度(oxygen saturation，SaO2)、二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)、乳酸(lactic acid，Lac)、葡萄糖(blood glucose，Glu)、堿剩余(base excess，BE)、緩沖堿(buffer base，BB)等指標。

1.6.2 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分評估大鼠后肢運動功能 采集動脈血后將脊髓損傷組、脊髓損傷+低壓組大鼠順序打亂，由3人在相互隔離環(huán)境下分別進行BBB評分，取平均值。

1.6.3 血細胞計數 再次經腹腔麻醉后，使用手術剪打開腹腔，暴露下腔靜脈，使用注射器經下腔靜脈采集靜脈血進行血細胞計數，包括白細胞計數(WBC)、中性粒細胞百分比(NEUT%)、淋巴細胞百分比(LYMPH%)、單核細胞百分比(MONO%)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細胞比容(HCT)、網織紅細胞計數(Ret)及網織紅細胞百分比(Ret%)等指標。

1.7 肺組織及脊髓損傷區(qū)組織病理學檢測 采集右肺下葉及C5對應的脊髓節(jié)段，常規(guī)方法組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，厚度3 μm。切片脫蠟至水，行HE染色，顯微鏡下觀察出血、間質水腫及炎性細胞浸潤情況。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據以±s表示，動脈血氣及血細胞計數指標多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用獨立樣本Kruskal-Wallis法進行非參數檢驗。BBB評分組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組動脈血氣指標比較 3 組大鼠p H、PaO2、PaCO2、SaO2、Glu、Lac、BE、BB等動脈 血氣指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05， 表1)。

2.2 各組血細胞計數結果比較 脊髓損傷組大鼠Ret%低于假手術組(P=0.034)；脊髓損傷+低壓組與假手術組、脊髓損傷組大鼠Ret%比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.178，P=0.282)。3組大鼠WBC、NEUT%、LYMPH%、MONO%、RBC、HGB、HCT、Ret等指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表1 各組實驗大鼠動脈血氣指標比較(±s)Tab.1 Comparison of the arterial blood gas indexes in each group (±s)

表1 各組實驗大鼠動脈血氣指標比較(±s)Tab.1 Comparison of the arterial blood gas indexes in each group (±s)

PaO2. 氧分壓；PaCO2. 二氧化碳分壓；SaO2. 氧飽和度；Lac. 乳酸；Glu. 葡萄糖；BE. 堿剩余；BB. 緩沖堿

組別 pH PaO2(mmHg) PaCO2(mmHg) SaO2(%) Lac(mmol/L) Glu(mmol/L) BE(mmol/L) BB(mmol/L)假手術組(n=4) 7.51±0.03 92.75±14.80 33.50±1.29 92.33±5.83 1.03±0.13 9.03±1.47 3.60±2.50 3.98±2.28脊髓損傷組(n=8) 7.50±0.04 87.13±16.97 36.50±2.33 95.44±4.74 1.48±0.72 8.64±1.97 5.16±2.75 4.95±2.53脊髓損傷+低壓組(n=8) 7.50±0.09 102.00±12.43 32.25±5.80 96.61±2.54 2.49±3.30 8.65±1.96 1.50±4.61 1.98±4.36

表2 各組實驗大鼠血細胞計數比較(±s)Tab.2 Comparison of blood routine data in each group (±s)

表2 各組實驗大鼠血細胞計數比較(±s)Tab.2 Comparison of blood routine data in each group (±s)

WBC. 白細胞計數；NEUT%. 中性粒細胞百分比；LYMPH%. 淋巴細胞百分比；MONO%. 單核細胞百分比；RBC. 紅細胞計數；HGB.血紅蛋白；HCT. 紅細胞壓積；Ret. 網織紅細胞計數；Ret%. 網織紅細胞百分比；與假手術組比較，(1)P=0.034。

組別 WBC(×103/μl) NEUT% LYMPH% MONO% RBC(×106/μl)HGB(g/dl)HCT(%)Ret(×103/μl) Ret%(%)假手術組(n=4) 6.85±1.38 51.15±11.63 44.23±11.39 3.58±0.35 5.64±1.51 11.73±3.23 29.68±7.48 173.35±13.87 2.88±0.20脊髓損傷組(n=8) 7.85±1.57 54.81±11.04 38.20±9.79 4.93±3.42 6.42±0.92 12.38±1.69 34.38±6.50 133.25±51.88 2.05±0.69(1)脊髓損傷+低壓組(n=8) 7.65±1.75 51.66±11.54 40.00±9.65 6.21±2.89 6.05±1.77 12.23±3.92 33.26±10.39 154.64±39.58 2.37±0.59

2.3 脊髓損傷組、脊髓損傷+低壓組大鼠BBB評分比較 脊髓損傷組、脊髓損傷+低壓組大鼠BBB評分比較(7.54±6.02 vs. 9.92±5.95)，差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.794，P=0.440)。

2.4 肺組織及脊髓損傷區(qū)組織病理學變化 HE染色結果顯示，假手術組大鼠脊髓損傷區(qū)組織未見明顯出血及滲出性改變，結構完整。脊髓損傷組、脊髓損傷+低壓組大鼠脊髓損傷區(qū)均可見明顯出血、滲出、水腫性改變，其組織結構完整性與假手術組比較發(fā)生明顯改變，但兩組間組織結構完整性未見明顯差異(圖1)。各組大鼠肺泡內均未見明顯出血、滲出、水腫性改變，肺泡結構完整，無肺泡塌陷，間質亦未見明顯水腫及炎性浸潤(圖1)。

3 討 論

航空轉運具有不受道路交通條件限制、轉運速度快等優(yōu)勢[3-5]。目前美國及德國航空轉運體系的建設以轉運流程、裝備、護理及流行病學等方面為主，處于各國前列。關于航空轉運過程中特殊環(huán)境對患者病理生理的影響目前僅見少量報道，各國對于航空轉運建立的指南、規(guī)范等均是以地面環(huán)境為基礎，通過理論推測及轉運經驗制定的。

圖1 各組實驗大鼠脊髓損傷區(qū)組織和肺組織病理學變化(HE ×40)Fig.1 Pathological changes of spinal cord injury area and lung tissues of each group of rats (HE ×40)

呼吸主要包括肺通氣、肺換氣和氧輸送3個部分。在部分無心肺基礎疾病的患者中，由顱腦及中樞神經系統(tǒng)損傷引起的肺水腫稱為神經源性肺水腫(neurogenic pulmonary edema，NPE)。目前NPE的發(fā)病機制尚不明確，存在血流動力學理論、肺血管通透性增加理論、沖擊傷理論等多種解釋。NPE的發(fā)病機制雖未明確，但其最終表現形式為肺水腫。本研究HE染色結果顯示，3組大鼠肺組織均未見明顯出血、間質滲出及水腫性改變，血細胞計數亦未見明顯變化，動脈血氣未見呼吸衰竭表現，表明實驗動物未發(fā)生NPE，即4 h的低壓低氧環(huán)境并未引起C5脊髓損傷大鼠的肺換氣障礙。

肺通氣主要受氣道情況及膈肌運動的影響[6]。 人類最重要的呼吸肌膈肌的支配神經膈神經由C3-C5組成，其中C4是主要成分。C1-C2損傷的傷病員往往在現場即已死亡；由于C3-C4損傷可影響膈神經中樞，C3-C4損傷的傷病員也常于早期因呼吸衰竭而死亡。本課題組前期預實驗中C1-C3損傷大鼠基本上在造模后0.5 h內即死亡，C4損傷大鼠4 h內死亡率約為50%，C5損傷大鼠在同一批次實驗中死亡均為1～2只，因此本研究選擇C5作為實驗節(jié)段。創(chuàng)傷性脊髓損傷最常發(fā)生于頸椎(60%)[1]，提示一旦發(fā)生脊髓損傷，多數患者會出現呼吸功能異常，一方面膈肌功能受損，深呼吸及排痰功能異常，引起通氣功能障礙；另一方面損傷節(jié)段以下出現感覺及運動障礙，心理壓力增大，引起機體耗氧量增加。肺通氣的動力來源于大氣壓與肺內壓的差值，阻力主要包括彈性阻力和非彈性阻力，其中彈性阻力來自于肺本身，約占肺通氣阻力的2/3，非彈性阻力主要來自于氣道阻力，氣道阻力與大氣壓和肺內壓的差值成正比。SCI后神經功能受損主要影響膈肌運動，導致大氣壓與肺內壓的差值減小，但占據肺通氣阻力主要部分的彈性阻力并未改變，因此肺通氣受限。本研究中雖然脊髓損傷組大鼠PaCO2較假手術組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義，提示C5損傷雖然對呼吸功能有所影響，但因其并非膈神經的主要成分，并未對肺通氣功能造成明顯影響。

航空環(huán)境中的低氧主要是由于大氣壓降低而導致氧分壓下降。民航密封艙內壓力通常維持在海拔2000～3000 m水平，在該高度下大氣壓在69～78 kPa，相應的氧分壓亦降至海平面的70%左右，因此既往多認為飛機艙內低壓環(huán)境會導致動脈氧分壓下降[7]。本研究中脊髓損傷+低壓組大鼠血氣結果并未進一步惡化，氧分壓反而有所上升，結合PaCO2結果，分析原因為膈神經主要是由C4組成，C5損傷尚未對呼吸中樞至膈肌的調控能力造成不可逆的損傷，航空環(huán)境中的低氧并未達到引起脊髓損傷+低壓組大鼠血氣結果明顯惡化的程度，即4 h的低壓低氧環(huán)境并未對C5脊髓損傷大鼠的肺通氣功能造成影響。

目前對于低氧導致腎臟促紅細胞生成素(EPO)增加進而加速紅細胞生成這一過程的具體機制尚未完全明確[8]。目前研究表明，在2000 m海拔水平暴露時間以“周”為單位時，可引起明顯的血液學改變[9]。雖然航空轉運過程中艙內壓力維持在2500 m左右水平，但轉運時間通常為4～6 h，即使跨洲轉運，轉運時間亦不會超過一周，因此并不會對紅細胞及血紅蛋白造成明顯影響，本研究中雖然假手術組、脊髓損傷組Ret%差異有統(tǒng)計學意義，但在實際臨床中并無太大實際意義，因此氧輸送過程并無明顯變化。

尚詠等[10]發(fā)現，航空運送過程中的低壓低氧環(huán)境不會導致脊髓損傷大鼠運動功能及脊髓損傷情況發(fā)生變化，與本研究結果一致，表明大鼠模型病理變化過程受操作、麻醉等因素影響較小。但其大鼠的氧分壓及PaCO2結果與本研究結果差別較大，本研究造模與低壓處理之間相隔24 h，并且通過頸動脈插管抽取動脈血，基本可排除麻醉、手術等操作對實驗動物的影響，而尚詠等[10]的研究是在造模同一天進行低壓處理，并在麻醉后抽取動脈血，結果相差較大可能與此有關。

假手術組大鼠未進行脊髓損傷手術，因此僅脊髓損傷組、脊髓損傷+低壓組大鼠在動脈血氣分析后進行BBB評分，結果顯示兩組BBB評分差異不明顯。BBB評分主要評估大鼠的運動功能，而運動功能的變化通常需要數周或數月的時間。因此，即使4 h的低壓過程會影響受傷部位的炎癥反應，28 h仍不足以使兩組大鼠的運動功能產生明顯的變化。由此可見，短期航空運輸不會進一步加重脊髓損傷，但是否會影響脊髓損傷患者的后期康復尚需進一步研究。而更長的轉運時間或不同的轉運等待時間、其他脊髓節(jié)段或多節(jié)段損傷情況如何尚需進一步動物實驗及臨床病例來驗證。

本研究未能對呼吸頻率、潮氣量、每分鐘通氣量、第一秒用力呼氣容積等呼吸參數進行檢測。呼吸參數及動脈血氣分析均須在大鼠離開低壓艙后的數分鐘內進行，否則無意義。動脈血氣分析可比呼吸參數更好地反映大鼠的呼吸功能，因此本研究選擇動脈血氣分析。脊髓損傷組和脊髓損傷+低壓組大鼠BBB評分之間的個體差異較大，分析原因為：①本研究使用壓迫法造模。用于壓迫的金屬棒的接觸表面相同，但各大鼠脊髓直徑存在差異，且金屬棒的直徑小于脊髓的直徑，無法精確地保證壓迫的確切位置。在預試驗中，重物墜落(WD)法同樣存在不同大鼠BBB評分個體差異較大的問題，而壓迫法可以確保建模時間的一致性。②BBB評分包括22個等級，以后肢運動功能評估脊髓損傷后的恢復情況。在進行評分時，必須同時觀察前肢作為比較以評估后肢的運動情況。因此，主要評價對象為胸腰椎脊髓損傷的動物。本研究中大鼠脊髓損傷段為C5，會影響前肢的運動，因此，當用前肢作為對照時，會不可避免地影響評分的準確性。

綜上所述，既往認為航空轉運中的低壓低氧環(huán)境會影響SCI患者的呼吸功能，但本研究結果提示，至少4 h的低壓低氧環(huán)境并不會對C5脊髓損傷大鼠的呼吸及運動功能造成明顯影響。