楊屹，黃啟林，羅晨，劉立業(yè)，孫紅玉*，湯禮軍*

1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610003；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心，四川省胰腺損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610083

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種以胰腺損傷和全身炎癥為特征的常見外科急腹癥[1]。 根據(jù)發(fā)病誘因不同，A P 可分為膽源性胰腺炎、酒精性胰腺炎和高甘油三酯性急性胰腺炎(hypertriglyceridemic acute pancreatitis，HTG-AP)等。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國民飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國HTG-AP 的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2-3]。國內(nèi)一項(xiàng)多中心研究發(fā)現(xiàn)，高三酰甘油已經(jīng)超過乙醇，成為胰腺炎發(fā)病的第二大誘因[4]。相較于其他原因引起的AP，HTG-AP患者更易發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官衰竭[5-6]，具有病情易重癥化的特點(diǎn)。本研究通過對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞極化表型進(jìn)行分析，探究了HTG-AP重癥化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 泊洛沙姆407(Poloxamer 407，P-407)、雨蛙素購自美國Sigma-Aldrich公司；動(dòng)物用異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；小鼠胰淀粉酶(amylase，AMY)ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-10微球檢測(cytometric bead array，CBA)試劑盒，anti-CD16/32抗體，BB700-conjugated anti-CD11c抗體，PE-conjugated anti-F4/80抗體，Transcription Factor Buffer Set購自美國BD公司；APC-conjugated anti-CD206抗體、LIVE/DEAD? Dead Cell Stain Kit購自美國Thermo Fisher公司。小動(dòng)物麻醉機(jī)購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；CANTO-Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 8 周齡雄性SP F 級(jí)C57BL/6J小鼠，體重18～20 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)組、AP組和HTG-AP組，每組8只，12 h晝夜交替光照，自由進(jìn)食飲水。參考Pan等[7]的方法構(gòu)建HTG-AP小鼠模型。HTG組和HTG-AP組小鼠隔天1次予以0.5 g/kg P-407腹腔注射誘導(dǎo)HTG，對(duì)照組和AP組注射等量生理鹽水；28 d后AP組和HTG-AP組以雨蛙素50 μg/kg 腹腔注射，1次/h，共9次，構(gòu)建AP模型，對(duì)照組和HTG組以同樣方式注射等量生理鹽水。最后一次注射雨蛙素12 h后，采用PBS灌洗腹腔，收集腹腔巨噬細(xì)胞；用促凝采血管收集血液標(biāo)本制備血清；并留取胰腺組織標(biāo)本，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程符合單位和國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.3 小鼠血清三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平測定 血清標(biāo)本送西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，按常規(guī)方法檢測TG、TC 水平。

1.4 小鼠血清AMY水平檢測 采用ELISA檢測小鼠血清AMY水平，具體操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，以全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的OD值。

1.5 小鼠胰腺病理組織學(xué)分析 胰腺組織以4%多聚甲醛固定過夜，依次脫水、石蠟包埋、制備4 μm切片、HE染色、封片，光學(xué)顯微鏡觀察。采用參考文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道的評(píng)分方法(表1)，從水腫、壞死和有核細(xì)胞浸潤3個(gè)維度，由2名病理醫(yī)師對(duì)組織損傷程度進(jìn)行雙盲評(píng)分。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，取其評(píng)分的平均值。

表1 胰腺損傷病理特點(diǎn)與評(píng)分Tab.1 Pathological characteristics and score of pancreatic injury

1.6 小鼠血清炎性因子檢測 采用CBA試劑盒，通過流式細(xì)胞儀對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平進(jìn)行檢測，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用FlowCytomix Pro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取及流式細(xì)胞術(shù)分析 小鼠麻醉后，用5 ml預(yù)冷PBS灌洗腹腔，按摩腹腔20 s后收集灌洗液[9]。經(jīng)PBS洗滌后，先用anti-CD16/32抗體封閉并以LIVE/DEADTMDead Cell Stain Kit區(qū)分死/活細(xì)胞；加入PE-conjugated anti-F4/80和BB700-conjugated anti-CD11c，分別作為巨噬細(xì)胞共同表面標(biāo)志和M1型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志；再以Transcription Factor Buffer Set破膜后加入APCconjugated anti-CD206，作為M2型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志。在冰上完成上述步驟后上機(jī)檢測，并用Flowjo軟件分析檢測結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠血清TG、TC及AMY水平比較 P-407腹腔注射造模28 d后，對(duì)照組、HTG組、AP組、HTG-AP 組血清TG 水平(m m o l/L)分別為0.5 2±0.0 7、37.25±2.01、0.545±0.05、38.14±2.47(圖1A)， 血清T C 水平(m m o l/L)分別為2.2 3±0.1 7、11.46±0.67、2.86±0.23、11.18±0.61(圖1B)。HTG組、HTG-AP組小鼠血清TG和TC濃度與其余兩組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，即HTG小鼠模型建立成功。對(duì)照組、HTG組、AP組、HTG-AP組血清AMY水平(ng/ml)分別為175.93±40.19、226.25±54.55、592.82±60.17、653.83±79.00(圖1C)，經(jīng)雨蛙素作用的AP組和HTG-AP組AMY水平明顯高于另外兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示AP造模成功。

2.2 小鼠胰腺組織損傷情況及病理評(píng)分比較 胰腺組織HE染色結(jié)果如圖2所示，AP組小鼠胰腺水腫明顯，小葉間隙廣泛增寬，小葉間隙和腺泡實(shí)質(zhì)均可見單核細(xì)胞浸潤，偶見小葉邊緣腺泡細(xì)胞壞死；HTG-AP組胰腺實(shí)質(zhì)中腺泡間隙增寬，胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，并有大量有核細(xì)胞浸潤，小葉邊緣局部壞死灶形成；對(duì)照組、HTG組胰腺無明顯水腫，結(jié)構(gòu)基本正常，HTG組胰腺實(shí)質(zhì)可見空泡狀的泡沫細(xì)胞形成。HTG-AP組小鼠胰腺組織病理評(píng)分為7.49±0.33，明顯高于AP組(5.15±0.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組小鼠血清TG、TC和AMY水平比較Fig.1 Comparison of levels of TG, TC and AMY in each group

圖2 各組小鼠胰腺組織損傷情況及病理評(píng)分Fig.2 Pancreatic tissue injury and histopathological scoring of mice in each group

2.3 小鼠血清炎性因子水平比較 CBA檢測結(jié)果顯示，HTG-AP組小鼠血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于AP組，抗炎因子IL-10水平明顯低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化表型比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，小鼠腹腔灌洗液巨噬細(xì)胞標(biāo)志F4/80陽性的細(xì)胞中，HTG-AP組M1型標(biāo)志CD11c陽性比例(35.5%±7.1%)明顯高于AP組(22.0%±2.8%)，M2型標(biāo)志CD206陽性比例(7.6%±1.9%)明顯低于AP組(16.5%±2.6%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平比較Fig.3 Comparison of levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in each group

圖4 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化表型的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig.4 Flow cytometry analysis of the polarization phenotype of mice peritoneal macrophages in each group

3 討 論

HTG-AP是指在滿足AP診斷的基礎(chǔ)上，患者發(fā)病時(shí)血清TG水平＞1000 mg/dl(11.3 mmol/L)[10]。研究表明，HTG-AP患者血清TG水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，是AP病情重癥化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。因此構(gòu)建穩(wěn)定的TG升高動(dòng)物模型對(duì)于HTG-AP發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義。

P-407是一類高分子非離子型表面活性劑，具有毒性低、對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物刺激性小的特點(diǎn)，可以抑制TG代謝中的關(guān)鍵酶——脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)和肝脂肪酶，導(dǎo)致TG水解速率減慢，引起血漿TG水平升高[12]。P-407誘導(dǎo)的TG升高具有劑量依賴性，且組內(nèi)均一性好，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定。而傳統(tǒng)的飲食誘導(dǎo)高脂血癥動(dòng)物模型，由于動(dòng)物進(jìn)食量不一及造模后期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長期進(jìn)食高脂食物產(chǎn)生的厭食現(xiàn)象，使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物TG水平常常不能達(dá)到HTG-AP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且不同個(gè)體間TG水平差異也較大。在本研究中，小鼠發(fā)生AP時(shí)TG水平超過正常值30倍以上(圖1A)，可有效模擬HTGAP患者發(fā)病時(shí)的嚴(yán)重高脂血癥狀態(tài)。

在本研究中，HTG-AP組胰腺組織比AP組表現(xiàn)出更嚴(yán)重的組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤和腺泡細(xì)胞壞死，病理損傷評(píng)分更高(圖2)。血清細(xì)胞因子檢測也發(fā)現(xiàn)，HTG-AP組促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等升高更為明顯，而抗炎因子IL-10雖相較于對(duì)照和HTG組也有所升高，但明顯低于AP組(圖3)。目前普遍認(rèn)為，血清TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子與AP及其誘發(fā)的急性肺損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13-14]。HTG-AP組表現(xiàn)出更嚴(yán)重的胰腺組織損傷和全身炎癥水平，這也與臨床研究中報(bào)道的HTG-AP患者易發(fā)生重癥化相符。巨噬細(xì)胞可能在這一過程中起著重要作用。

巨噬細(xì)胞是一類固有免疫細(xì)胞，具有高度的可塑性，可根據(jù)所處的微環(huán)境向經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage)，即M1型巨噬細(xì)胞，或替代性活化巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage)，即M2型巨噬細(xì)胞極化[15]。M1型巨噬細(xì)胞可釋放大量炎性因子，殺死病原體并激活免疫系統(tǒng)；M2型巨噬細(xì)胞則主要發(fā)揮抗炎、促進(jìn)傷口愈合及組織修復(fù)等作用。在AP發(fā)病時(shí)，腹腔內(nèi)會(huì)產(chǎn)生胰腺炎相關(guān)腹水(pancreatitis associated ascitic fluids，PAAF)，其中含有細(xì)胞因子、淀粉酶、游離脂肪酸等多種物質(zhì)[16]。最新研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞吞噬并在胞內(nèi)活化的胰蛋白酶可激活NF-κB信號(hào)通路，釋放大量炎性因子，引發(fā)胰腺損傷和炎癥反應(yīng)[17]。 腹腔巨噬細(xì)胞可直接與PAAF接觸，迅速激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放大炎癥信號(hào)。而且，促使腹腔巨噬細(xì)胞向M2極化有助于AP病情緩解[18]。因此，腹腔巨噬細(xì)胞極化表型對(duì)于AP病情發(fā)展具有重要意義。

高脂環(huán)境下巨噬細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)免疫應(yīng)答強(qiáng)度增強(qiáng)[19]。研究表明，巨噬細(xì)胞用三酰甘油分解后的產(chǎn)物軟脂酸干預(yù)后，在遭遇炎癥刺激時(shí)會(huì)誘發(fā)更強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，M1極化相關(guān)蛋白表達(dá)量顯著增加[20]。高脂環(huán)境下單核巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后可激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子分泌增加[21]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)能與巨噬細(xì)胞表面的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)識(shí)別受體結(jié)合，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、TNF-α和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP1)等，使機(jī)體持續(xù)處于炎癥狀態(tài)[22]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，未誘發(fā)AP的HTG組小鼠血清中，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均高于對(duì)照組(圖3)， 表明HTG可改變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物炎癥水平。此外，HTG組小鼠胰腺中出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后形成的泡沫細(xì)胞(圖2)。HTG環(huán)境下血液循環(huán)中的單核巨噬細(xì)胞更多向血管外游出，向組織中浸 潤[23]。胰腺腺泡細(xì)胞損傷后泄露到胞外的高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和雙鏈DNA等DAMPs可有效激活巨噬細(xì)胞，促使巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子[24]。因此，高脂環(huán)境下胰腺中增多的巨噬細(xì)胞可能更高效地將包括腹腔巨噬細(xì)胞在內(nèi)的其他部位免疫細(xì)胞招募到發(fā)炎的胰腺組織，加重局部組織損傷，放大炎癥信號(hào)。

腹腔巨噬細(xì)胞是AP時(shí)胰腺組織中被招募的巨噬細(xì)胞的重要來源之一。研究表明，AP發(fā)生后腹腔巨噬細(xì)胞能透過胰腺包膜并浸潤胰腺組織[25]。本研究通過流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，相較于AP組而言，HTG-AP組腹腔巨噬細(xì)胞M1極化增多，M2極化減少(圖4)。因此，浸潤到胰腺組織的M1型巨噬細(xì)胞比例增加可能是HTG-AP組胰腺組織損傷更嚴(yán)重的原因之一。近來有研究報(bào)道HTG導(dǎo)致AP發(fā)病以后胰腺組織損傷修復(fù)速度放緩[26]。這可能與M2型巨噬細(xì)胞比例減少有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HTG-AP小鼠具有胰腺組織損傷加重和全身炎癥水平升高的特點(diǎn)，這可能與高脂環(huán)境下腹腔巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變有關(guān)。