王旭輝，王鵬輝，潘藝青，王瓊*，殷敏毅*

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院血管外科/上海交通大學(xué)血管病診治中心，上海 200011；2上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系，上海 200025

深靜脈血栓形成后綜合征(post-thrombotic syndrome，PTS)是由急性深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)發(fā)展而來的慢性靜脈功能不全性疾病。DVT抗凝溶栓存在一定的適應(yīng)證和禁忌證，彈力襪對PTS的預(yù)防作用尚存在爭議，支架治療法具有侵入性且存在并發(fā)癥[1-2]。因此，了解DVT發(fā)展成PTS的發(fā)病機(jī)制，可為PTS的預(yù)防提供新的思路。已知DVT后受損靜脈管壁中膜平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)向合成型轉(zhuǎn)化時，可分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，且管壁增厚變硬導(dǎo)致靜脈高壓而出現(xiàn)臨床癥狀[3-5]。SMC作為血管(包括靜脈)中膜的主要細(xì)胞成分，主要存在收縮型和合成型兩種表型。生理狀態(tài)下，SMC主要表現(xiàn)為收縮型從而維持和調(diào)節(jié)靜脈壁張力，控制血液從外周返流回心臟。在病理條件如損傷、炎癥、理化等因素刺激下，SMC可由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，主要表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、彈力蛋白(Elastin)等收縮型標(biāo)志物表達(dá)降低，伴隨ECM分泌增多[6-7]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動物中存在三種轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)異構(gòu)體(TGF-β1、β2、β3)，在血管疾病中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能[8]。其中，TGF-β1可通過促進(jìn)SMC凋亡和遷移，參與螺旋動脈重塑，進(jìn)而維持正常妊娠[9-10]；TGF-β3可通過抑制Wnt16-Notch信號通路，促進(jìn)SMC向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9,11]；TGF-β2對SMC的增殖、遷移和基質(zhì)沉積具有重要的調(diào)節(jié)功能，但其在PTS管壁SMC表型轉(zhuǎn)化中的作用尚不明確[12]。本研究探討靜脈血栓后管壁重塑過程中TGF-β2調(diào)控SMC表型轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制，以期為臨床PTS的治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞實驗

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青/鏈霉素)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HVSMC，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時，按1:2的比例傳代培養(yǎng)。將HVSMC以2×105個/孔的密度接種在6孔板上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。處理細(xì)胞前更換完全培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基并培養(yǎng)16～18 h。

1.1.3 實驗分組和處理 設(shè)置空白對照，并按TGF-β2濃度梯度(0、1、10、20 ng/ml)進(jìn)行分組，刺激HVSMC 24 h后提取RNA。設(shè)置空白對照，以10 ng/ml TGF-β2刺激HVSMC 0、2、6、24 h后提取RNA。

1.1.4 實時熒光定量PCR(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)檢測HVSMCs表型標(biāo)志物mRNA的表達(dá) 使用1 ml Trizol裂解6孔板各孔HVSMCs，用200 ml氯仿提取RNA，12 000 r/min 離心15 min，上清液用等量異丙醇沉淀，再用1 ml 75%和100%乙醇各洗滌1次，風(fēng)干，加20 ml去RNA酶的水，溶解，測濃度。以1000 ng RNA在42 ℃、45 min和85 ℃、15 s的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選擇目的基因的特異性引物，通過RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠19只，4～6周齡，體重(200±50) g，購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。本研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審批(批準(zhǔn)文號：A-2019-057)。

表1 HVSMCs表型標(biāo)志物RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences of HVSMCs phenotype markers

1.2.2 大鼠下腔靜脈血栓模型建立與驗證 按照文獻(xiàn)[13]的方法建立大鼠下腔靜脈血栓模型。在新環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周后，給予0.6%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在顯微鏡下打開腹腔，游離腹主動脈、下腔靜脈及輸尿管，使用無齒鑷在左腎靜脈和下腔靜脈匯合處向遠(yuǎn)心端依次鉗夾5次后，用6-0細(xì)線分別穿過下腔靜脈和腹主動脈以及下腔靜脈和輸尿管之間的間隙，在緊鄰鉗夾部位近心端完全結(jié)扎下腔靜脈后即可關(guān)腹。血栓造模術(shù)后第4天，HE和Masson染色觀察下腔靜脈管腔內(nèi)急性期血栓形成；第7天，HE和Masson染色觀察下腔靜脈慢性期血栓機(jī)化再通，以證實大鼠下腔靜脈血栓造模成功。第14天，RT-PCR檢測血栓段靜脈管壁和正常靜脈管壁SMC表型標(biāo)志物的表達(dá)水平，驗證血栓后管壁SMC表型的轉(zhuǎn)化。

1.2.3 實驗分組及處理 下腔靜脈血栓造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為血栓組(n=9)與TGF-β2實驗組(n=5)，同時設(shè)置假手術(shù)組(n=5)作為陰性對照。血栓造模術(shù)后第14天，大鼠給予0.6%戊巴比妥鈉麻醉后再次打開腹腔，游離下腔靜脈結(jié)扎線遠(yuǎn)心端和后腹膜間的腔隙后，分別將含TGF-β2(TGF-β2實驗組，10 ng/只)和未含TGF-β2(血栓組)的水凝膠注射在此腔隙，2～4 min凝膠凝固后關(guān)腹。24 h后，在緊鄰下腔靜脈結(jié)扎線近心端和右側(cè)分支分出部位近心端之間取材。假手術(shù)組僅打開腹腔但不結(jié)扎下腔靜脈或僅游離下腔靜脈和后腹膜間腔隙但不注入水 凝膠。

對照組患者早上空腹口服藏藥二十五味珍珠丸（1粒/次）、早上餐后口服二十味沉香丸（1粒/次）、晚上餐后服用八味沉香散（1 g/次），治療時間為1周；觀察組將白石英1 g、小茴香2 g及肉豆蔻2 g研磨成末放入紗布中，為了便于操作以及避免燙傷，將小木棍插入紗布中間，將其包扎成小包后扎緊，將酥油或香油30 g放入小茶缸中加熱，把小藥包浸入其中，確定酥油均滲入到藥包中，將藥包取出，分別在患者機(jī)體各穴位涂抹剩余酥油，2次/d，以7 d為一療程。

1.2.4 RT-PCR檢測大鼠下腔靜脈管壁SMC表型標(biāo)志物mRNA的表達(dá) 將大鼠下腔靜脈血管剪碎，加入Trizol冰上碾磨并裂解，提取RNA，步驟詳見1.1.4。選擇目的基因的特異性引物，通過RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表2。

1.2.5 下腔靜脈病理學(xué)觀察 下腔靜脈取材后，用4%多聚甲醛室溫固定16～18 h，PBS清洗，75%乙醇過夜，按照85%(1 h)-95% Ⅰ(1 h)-95% Ⅱ(1 h)-100% Ⅰ(30 min)-100% Ⅱ(15 min)梯度乙醇脫水，隨后二甲苯Ⅰ(30 min)-Ⅱ(15 min)中透明，然后浸入石蠟Ⅰ(1.5 h)-Ⅱ(1.5 h)，最后將血管組織放入模具進(jìn)行包埋，包埋時結(jié)扎線端血管組織切面向下，使用豎立法完成包埋，切片機(jī)上制作5 μm厚度的切片。

表2 SMC表型標(biāo)志物RT-PCR引物序列Tab.2 RT-PCR primer sequences of SMC phenotype markers

1.2.5.1 HE染色 二甲苯Ⅰ(15 min)-Ⅱ(15 min)脫蠟；梯度乙醇100% Ⅰ(2 min)-100% Ⅱ(2 min)-95% Ⅰ(2 min)-95% Ⅱ(2 min)洗脫；蘇木精染色5 min，蒸餾水洗2 min；1%鹽酸乙醇2～5 s，蒸餾水洗5～7 min；1%伊紅染色2～4 min，蒸餾水洗1 min。100% Ⅰ(2 min)-100% Ⅱ(2 min)梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ(2 min)-Ⅱ(2 min)透明；切片風(fēng)干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5.2 Masson染色 切片常規(guī)脫蠟同1.2.5.1。蒸餾水洗后用Weigert蘇木精液染色5～10 min，1%鹽酸乙醇水化，蒸餾水清洗后，麗春紅-酸性品紅液浸染5～10 min，蒸餾水洗后1%磷鉬酸水溶液處理5 min，直接用苯胺藍(lán)液或綠液復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，最后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TGF-β2對HVSMC表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

2.1.1 不同濃度TGF-β2對HVSMC表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，不同濃度(0、1、10、20 ng/ml)TGF-β2處理后，HVSMC收縮型標(biāo)志物α-SMA、Elastin和合成型標(biāo)志物Col1A1的mR NA表達(dá)均明顯增加，且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05)，而合成型標(biāo)志物Col1A2 mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1)。在10 ng/ml和20 ng/ml TGF-β2刺激24 h條件下，HVSMC收縮型和合成型標(biāo)志物mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)明顯改變，但為了避免高濃度刺激可能引起的非特異性作用，故采用10 ng/ml作用條件進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度TGF-β2對HVSMC表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響(n=3～4)Fig.1 Effects of different concentrations of TGF-β2 on the expressions of HVSMC phenotypic markers mRNA (n=3-4)

2.1.2 固定濃度TGF-β2對HVSMC表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響 以10 ng/ml TGF-β2分別刺激HVSMC 0、2、6、24 h后，HVSMC收縮型標(biāo)志物α-SMA、Elastin和合成型標(biāo)志物Col1A1的mRNA表達(dá)隨時間延長逐步增加(P<0.05)，呈現(xiàn)時間依賴性。處理24 h后，收縮型標(biāo)志物α-SMA和Elastin mRNA的表達(dá)分別上調(diào)20倍和250倍；合成型標(biāo)志物Col1A1 mRNA的表達(dá)上調(diào)4倍(P<0.05)。Col1A2 mRNA的表達(dá)變化在各時間組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 固定濃度TGF-β2對HVSMC表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響(n=4)Fig.2 Effects of fixed concentration TGF-β2 on the expressions of HVSMC phenotypic markers mRNA (n=4)

2.2 大鼠下腔靜脈血栓模型建立與驗證結(jié)果

2.2.1 下腔靜脈血栓模型的建立及下腔靜脈病理學(xué)變化 造模后第4天，下腔靜脈取材前后，肉眼觀察到下腔靜脈管腔內(nèi)局部呈暗黑色，管腔充盈，提示內(nèi)部可能被實性血栓填充(圖3A、B，綠色箭頭)；HE和Masson染色結(jié)果顯示，下腔靜脈管壁局部擴(kuò)張明顯，管腔內(nèi)大量血栓形成，血栓邊緣可見炎性細(xì)胞浸潤，提示急性期血栓形成(圖3C、D)。造模后第7天，下腔靜脈取材前后，肉眼觀察到下腔靜脈管腔內(nèi)局部呈暗紅色，管腔內(nèi)局部“充盈缺損”，提示血栓部分溶解(圖3E、F，綠色箭頭)；HE和Masson染色結(jié)果顯示，血栓與靜脈管壁的間隙增大，提示血栓機(jī)化皺縮，并且血栓內(nèi)有新生的毛細(xì)血管，開始部分溶解再通(圖3G、H)。以上結(jié)果表明大鼠下腔靜脈血栓造模成功，并且第7天血栓已經(jīng)皺縮，內(nèi)有新生毛細(xì)血管形成，提示慢性期血栓開始機(jī)化再通。

2.2.2 大鼠下腔靜脈血栓形成后管壁SMC表型標(biāo)志物mRNA的表達(dá)情況 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，血栓組靜脈管壁SMC收縮型標(biāo)志物(α-SMA，Elastin) mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，合成型標(biāo)志物(Col1A1，Col1A2)mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01，圖4)。

2.3 TGF-β2作用下大鼠下腔靜脈血栓形成后靜脈管壁SMC表型標(biāo)志物表達(dá)和管壁厚度改變情況 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與血栓組比較，TGF-β2實驗組下腔靜脈管壁收縮型標(biāo)志物(α-SMA、Elastin)mRNA表達(dá)上調(diào)，合成型標(biāo)志物僅Col1A2 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05，圖5)。

圖3 造模后第4天急性期血栓形成及第7天慢性期血栓機(jī)化再通(HE和Masson染色，×40)Fig.3 Acute thrombosis on 4 days after surgery and chronic organized thrombus and recanalization on 7 days after surgery (HE and Masson staining, ×40)

圖4 大鼠下腔靜脈血栓形成后管壁SMC表型標(biāo)志物mRNA的表達(dá)(n=4～6)Fig.4 Expression of SMC phenotypic markers mRNA in the wall of rat inferior vena cava thrombus (n=4-6)

圖5 TGF-β2作用下大鼠下腔靜脈血栓形成后靜脈管壁SMC表型標(biāo)志物mRNA的表達(dá)(n=3～4)Fig.5 Under TGF-β2 action, the expression of SMC phenotypic markers mRNA in the wall of rat inferior vena cava thrombus (n=3-4)

HE和Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組下腔靜脈管壁呈不規(guī)則狀，且內(nèi)中膜較?。慌c假手術(shù)組比較，血栓組靜脈管壁內(nèi)中膜厚度增加；TGF-β2實驗組管壁內(nèi)中膜厚度較血栓組下降。提示局部使用TGF-β2能夠減少靜脈血栓后管壁厚度(圖6)。

圖6 下腔靜脈管壁病理學(xué)變化Fig.6 Pathological changes of the wall of inferior vena cava

3 討 論

目前，臨床上對DVT患者主要應(yīng)用抗凝藥物預(yù)防血栓的蔓延、栓塞和復(fù)發(fā)，以降低PTS發(fā)生率，但缺乏針對PTS的有效藥物[14]。既往研究表明，在DVT形成后受損靜脈管壁中存在SMC表型轉(zhuǎn)化的病理表現(xiàn)[3,5,15-16]。因此，本研究主要從SMC表型轉(zhuǎn)化的角度研究PTS的管壁重塑，探討TGF-β2在PTS管壁重塑中的作用，為臨床干預(yù)PTS的進(jìn)展提供理論依據(jù)。

哺乳動物中存在3種TGF-β異構(gòu)體(TGF-β1、β2、β3)，其中TGF-β1在血管內(nèi)膜高表達(dá)，TGF-β2主要表達(dá)于血管中膜，而TGF-β3在整個血管壁均有表達(dá)[8]。TGF-β信號通路在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、腫瘤和纖維化，以及維持血管和造血穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[8,17]。已有研究表明，TGF-β2是一種多效細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡以及ECM沉積等[11,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2對HVSMC收縮型和合成型標(biāo)志物的影響均呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，但TGF-β2主要刺激收縮型標(biāo)志物mRNA的表達(dá)上調(diào)，對合成型標(biāo)志物的影響較小，提示TGF-β2對血管SMC收縮功能的調(diào)節(jié)作用更加明顯；此外，TGF-β2對于合成型標(biāo)志物有一定的上調(diào)作用，推測可能與SMC胚胎起源的異質(zhì)性有關(guān)[8]。

下腔靜脈血栓模型廣泛應(yīng)用于研究血栓和血栓后管壁重塑，主要包括狹窄(部分結(jié)扎)模型和瘀滯(完全結(jié)扎)模型[19-20]。其中狹窄模型主要用于影響血栓形成方面的研究，而瘀滯模型的血栓形成率高達(dá)95%～100%，且血栓形成大小較均一，其應(yīng)用更廣泛，包括預(yù)防血栓形成、血栓溶解以及血栓形成后靜脈管壁重塑等方面的研究[19-20]。因此，本研究采用大鼠下腔靜脈瘀滯模型來探討TGF-β2對血栓形成后靜脈管壁重塑的作用。血栓根據(jù)疾病進(jìn)程可分為急性期、亞急性期和慢性期。大鼠新陳代謝速度比人類快，一般認(rèn)為≤3 d的大鼠靜脈血栓是急性的，血栓自然溶解可長達(dá)28 d[19]。因此，本研究在大鼠下腔靜脈血栓造模后第4天、第7天取材，通過HE染色和Masson染色檢測下腔靜脈管腔內(nèi)急性期血栓形成，以及血栓部分溶解和機(jī)化再通進(jìn)入慢性期，從而證實下腔靜脈血栓模型構(gòu)建成功。造模后第14天，血栓組下腔靜脈管壁中SMC收縮型標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，而合成型標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實血栓后靜脈管壁存在收縮型SMC向合成型轉(zhuǎn)變的病理學(xué)基礎(chǔ)。

水凝膠具有低毒性和良好的生物相容性，載藥局部處理可以減輕全身給藥引起的不良反應(yīng)。本研究使用水凝膠載TGF-β2局部處理下腔靜脈管壁[21]， 結(jié)果顯示，處理24 h后，靜脈管壁SMC的收縮型和合成型標(biāo)志物mRNA表達(dá)均增加，其中收縮型標(biāo)志物mRNA表達(dá)增加更為明顯，表明TGF-β2有利于維持血栓形成后靜脈管壁SMC的收縮表型。這與TGF-β2在HVSMC中的作用結(jié)果基本一致，提示TGF-β2主要刺激收縮型標(biāo)志物的表達(dá)。既往研究報道，在下腔靜脈血栓動物模型中，血栓段靜脈管壁增厚[22-23]。本研究采用Masson染色法測量內(nèi)中膜厚度發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，血栓組靜脈壁內(nèi)中膜厚度明顯增加；與血栓組比較，TGF-β2實驗組靜脈管壁內(nèi)中膜厚度明顯下降。提示TGF-β2可減輕靜脈管壁的增厚程度。

綜上所述，在體外和動物體內(nèi)實驗中，TGF-β2主要刺激血管SMC收縮型標(biāo)志物的表達(dá)。當(dāng)靜脈血栓形成后，大鼠血栓段靜脈管壁中收縮型SMC向合成型轉(zhuǎn)化。局部使用TGF-β2可上調(diào)SMC收縮型標(biāo)志物的表達(dá)，有利于維持血栓段靜脈管壁SMC的收縮表型，為臨床干預(yù)PTS的進(jìn)展提供了理論依據(jù)和新的治療方案。