朱秋楠 于榮 王少云 馬曉芳(寧夏泰益欣生物科技有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

維生素B6(Vitamin B6，簡(jiǎn)稱VB6)在自然界中以吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺三種形式存在，在醫(yī)療、食品、飼料及化妝品工業(yè)上有著廣泛的用途[1-2]。近年來，我國(guó)在維生素B6生產(chǎn)中采用了先進(jìn)的草酰唑工藝，降低了生產(chǎn)成本，增強(qiáng)了國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力[3-4]。維生素B6的檢測(cè)早有報(bào)道，但其中間體的檢測(cè)多用氣相色譜，未見高效液相色譜的檢測(cè)方法[5-7]。本文擬采用高效液相色譜法建立了一種測(cè)定維生素B6中間體N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(1)和4-甲基-5乙氧基噁唑(2)的快速檢測(cè)方法，旨在解決維生素B6中間體沸點(diǎn)高、極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的化合物不能用氣相色譜檢測(cè)的限制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

島津LC-20AT-PDA高效液相色譜儀(色譜柱：XBridge C18，4.6*250mm，5μm；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器)；Sartorius BSA224S 分析天平(萬(wàn)分之一)。

1.1.2 試劑

N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥93%，自制)；4-甲基-5乙氧基噁唑標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥96%，自制)；色譜純乙腈；優(yōu)級(jí)純高氯酸鈉；二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱為：XBridge C18，4.6*250mm，5μm，柱溫為30℃；以高氯酸鈉溶液(pH=2.3～2.7)和乙腈(60+40，V1+V2)溶液為流動(dòng)相，流動(dòng)相的流速為0.5mL/min、進(jìn)樣體積為20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為：220nm。

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取定量標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.0001g)置于25mL容量瓶中，加入少許甲醇溶液溶解，用蒸餾水稀釋至刻度定容，搖勻、配制成濃度為4.0μg/mL的標(biāo)樣，經(jīng)0.45μm微孔過濾膜過濾后按照上述色譜條件測(cè)定。

1.3.2 樣品溶液配制

稱取定量試樣(精確至0.0001g)置于25mL容量瓶中，加入少許甲醇溶解樣品，用蒸餾水稀釋至刻度定容。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

將標(biāo)樣稀釋為2.0μg/mL進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)信噪比為3和10確定檢測(cè)限和定量限分別為0.016μg/mL 和0.052μg/mL。N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中間體1)和4-甲基-5乙氧基噁唑(中間體2)的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品中間體1和2的 HPLC色譜圖

根據(jù)圖1結(jié)果顯示，N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中間體1)的相對(duì)保留時(shí)間為8.8,4-甲基-5-乙氧基噁唑(中間體2)的相對(duì)保留時(shí)間為10.0；峰度較強(qiáng)、且未見干擾吸收峰，說明該方法可以用于中間體1和中間體2的檢測(cè)。

2.2 各物質(zhì)線性關(guān)系

將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋不同倍數(shù)得到N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中間體1)和4-甲基-5-乙氧基噁唑(中間體2)的0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL 和4.0μg/mL 不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述色譜條件，測(cè)定相應(yīng)的響應(yīng)值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如表1所示。

表1 線性方程

2.3 精密度測(cè)定

分別取中間體1和中間體2的小試樣品各10個(gè)在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，每一個(gè)樣連續(xù)、精確重復(fù)測(cè)定10次，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

根據(jù)表2結(jié)果顯示，N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中間體1)和4-甲基-5-乙氧基噁唑(中間體2)的標(biāo)準(zhǔn)偏差與變異系數(shù)均小于5%；說明該方法用于檢測(cè)中間體1和中間體2具有較好的重現(xiàn)性。

表2 中間體1和2重現(xiàn)性的測(cè)定結(jié)果

2.4 準(zhǔn)確度測(cè)定

分別稱取5個(gè)N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯和4-甲基-5乙氧基噁唑樣品，在每個(gè)樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，在上述色譜條件下檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 中間體1和2準(zhǔn)確度的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表3結(jié)果顯示，N-乙氧草酰-L-丙氨酸乙酯(中間體1)和4-甲基-5-乙氧基噁唑(中間體2)的回收率分別為98.16% ～100.29%、98.92%～100.23%；說明該方法用于檢測(cè)中間體1和中間體2具有較好的精確度。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法可以很好的檢測(cè)維生素B6中間體1和2，中間體1的質(zhì)量濃度與峰面積曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9970，標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值為0.12，變異系數(shù)最大值0.13%，回收率為98.16%～100.29%，中間體2質(zhì)量濃度與峰面積曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9910，標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值為0.61，變異系數(shù)最大值0.66%，回收率為98.92%～100.23%，目標(biāo)峰無拖尾、無分叉、分離度高，適用于維生素B6中間體的檢測(cè)，且分析準(zhǔn)確度好，精密度高，方便可行，為維生素B6的生產(chǎn)過程監(jiān)控提供了方法。