康坤，王俊斌,2,通信作者，王海鳳，王鳳堂，王耀國，王昊

碧根果殼總黃酮的提取工藝優(yōu)化和抗氧化活性研究

康坤1，王俊斌1,2,通信作者，王海鳳3，王鳳堂1，王耀國1，王昊1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院 化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，天津 300384；3. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測試中心，天津 300384；）

以碧根果殼為材料，采用超聲輔助浸提法提取總黃酮。以總黃酮提取率為評價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用正交法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并考察碧根果殼黃酮提取物對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、超氧陰離子自由基的清除能力。結(jié)果表明：在乙醇濃度為65 %、料液比為1∶30、提取溫度為40 ℃、提取時(shí)間為50 min的條件下，碧根果殼總黃酮提取率達(dá)到最高。在一定濃度范圍內(nèi)，碧根果殼黃酮提取物的濃度越大，其抗氧化能力也越高。

碧根果殼；總黃酮；正交試驗(yàn)；抗氧化能力

碧根果又名薄殼山核桃、長壽果，是美國山核桃的果實(shí)，原產(chǎn)于美國與墨西哥，是世界十大堅(jiān)果之一[1]。碧根果的果肉營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、碳水化合物、多種礦物質(zhì)元素和維生素，同時(shí)還具有補(bǔ)腎健腦、補(bǔ)中益氣、潤肌膚、烏須發(fā)等藥用功效，因此成為備受青睞的營養(yǎng)和休閑食品[1-2]。但對于碧根果的果殼，絕大多數(shù)作為垃圾進(jìn)行處理，既污染環(huán)境又浪費(fèi)資源。作為食用堅(jiān)果的副產(chǎn)物，堅(jiān)果殼資源豐富，其中的黃酮、多酚、多糖和色素類化合物的活性功能及應(yīng)用開發(fā)價(jià)值正受到越來越多的關(guān)注[3-4]。近年來，利用微波和超聲輔助方法，一些研究者對堅(jiān)果殼中多酚、多糖和黃酮類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了研究，并證明堅(jiān)果殼提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性[5-8]。但相關(guān)研究還比較少，對堅(jiān)果殼的生物活性物質(zhì)提取及功能研究亟待進(jìn)一步加強(qiáng)。

本研究以碧根果殼為原料，乙醇為溶劑，超聲波輔助提取碧根果殼中的總黃酮，用正交試驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，以維生素C為對照，就碧根果殼中總黃酮對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、超氧陰離子自由基的清除能力為指標(biāo)進(jìn)行研究，為碧根果殼的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料和試劑：碧根果購自當(dāng)?shù)爻?，手工剝殼、去雜，粉碎后過60目篩。蘆丁（Rutin）標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所。無水乙醇、氫氧化鉀、DPPH、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、維生素C均為分析純。

儀器：HHS-11-4數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋；UV-2100紫外分光光度計(jì)；TDL80-2B臺式離心機(jī)；FA1204B電子天平；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DF-15型臺式連續(xù)投料粉碎機(jī)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁20 mg置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容。精密稱取蘆丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL比色管中，加60%乙醇10 mL，加5%亞硝酸鈉溶液 1 mL，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min。分別取10 mL置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度[9]。在510 nm波長下測定吸光度，以吸光度對蘆丁濃度（mg/mL）進(jìn)行線性回歸，得方程：＝8.358 9＋0.02，＝0.994 4。

1.3 碧根果殼總黃酮的提取及測定

稱取適量的碧根果殼粉末置于250 mL瓶中，加入一定濃度乙醇溶液超聲加熱提取一定時(shí)間，將提取后的溶液過濾，棄掉濾渣，并在4 000 r/min條件下離心5 min，對上清液進(jìn)行水浴加熱并濃縮，濃縮至提取物質(zhì)量濃度約為1 g/mL，備用。將濾液定容至100 mL，按照1.2方法測其吸光度值，帶入回歸方程求得提取液中黃酮的質(zhì)量濃度[10]，按公式（1）計(jì)算總黃酮提取率：

式中：——總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

——總黃酮提取液體積，mL；

——粉末質(zhì)量，mg

1.4 單因素試驗(yàn)

在超聲波輔助提取條件（固定超聲功率200 W）下，分別考察乙醇濃度（55%、65%、75%、85%、95%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL）、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）4個(gè)因素對提取效果的影響。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取率為評價(jià)指標(biāo)，以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.6 DPPH自由基清除能力測定

于2.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液中分別加0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的提取液1 mL，反應(yīng)30 min后在波長517 nm處測吸光度，記為i，同時(shí)測2.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液與1.0 mL乙醇混合液的吸光度記為c，2.5 mL無水乙醇與不同質(zhì)量濃度的1 mL提取液混合液的吸光度記為b。同時(shí)，以同濃度維生素C作陽性對照，碧根果殼總黃酮對DPPH自由基的清除率按公式（2）計(jì)算[11-12]。

1.7 超氧陰離子自由基的清除能力測定

配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的樣品提取液，待用。在5支具塞刻度試管中依次加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）2.5 mL，置于25 ℃水浴中保溫20 min，分別加入0.2 mL不同質(zhì)量濃度樣品提取液，0.98 mmol/L NBT溶液0.6 mL和10 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，立即加入0.1 mL 8 mol/L HCl終止反應(yīng)，于530 nm處測定吸光度（x），空白對照組以等體積溶劑代替樣品提取液，吸光度記為0，陽性對照組以相同體積和濃度的維生素C溶液代替樣品[7,13]。按公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮提取效果的影響

由圖1可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著提取溶劑濃度的升高，總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，乙醇濃度為65%時(shí)，提取率最高。隨后，提取率隨著乙醇濃度升高而下降，原因可能是較高濃度的乙醇導(dǎo)致非黃酮類的一些脂溶性物質(zhì)溶出，造成體系中黃酮含量下降。

圖1 乙醇濃度對提取效果的影響

2.1.2 料液比對總黃酮提取效果的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比在（1∶10）～（1∶20）時(shí)，隨著料液比的升高，碧根果殼黃酮提取率逐漸提高，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，黃酮含量達(dá)最大值，繼續(xù)增大料液比則提取率下降。原因可能是隨著材料繼續(xù)增加，雜質(zhì)隨之增加，導(dǎo)致溶解在體系中的黃酮比例下降[7]。

圖2 料液比對提取效果的影響

2.1.3 提取溫度對總黃酮提取效果的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值。隨著溫度的升高，熱效應(yīng)使分子的運(yùn)動加速，提取率開始增大，但隨著溫度再繼續(xù)升高，部分黃酮成分受到高溫破壞[14]。因此，溫度高于50 ℃時(shí)，黃酮含量逐漸下降。

圖3 溫度對提取效果的影響

2.1.4 提取時(shí)間對總黃酮提取效果的影響

由圖4可知，在10～30 min時(shí)，提取物中總黃酮含量隨提取時(shí)間的增加而明顯升高，30～ 40 min時(shí)只緩慢升高，并不明顯。隨著超聲提取時(shí)間的繼續(xù)增加，總黃酮提取率下降。較長的提取時(shí)間可使黃酮盡可能提取完全，但也容易引入雜質(zhì)，并造成時(shí)間、能源成本的增加。因此，提取時(shí)間在30～40 min 比較合適。

圖4 提取時(shí)間對提取效果的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過正交試驗(yàn)確定了最佳提取條件。由表2可知，超聲提取碧根果殼總黃酮的最佳工藝條件為A1B3C1D3，即乙醇濃度65%，料液比1∶30，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間50 min。此工藝下總黃酮提取率為1.932%。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各因素所對應(yīng)的極差值，可知各因素對試驗(yàn)指標(biāo)影響的順序?yàn)椋禾崛囟龋–）＞乙醇濃度（A）＞ 提取時(shí)間（D）＞料液比（B）。由此可以看出，在碧根果殼黃酮的提取過程中，提取溫度和提取溶劑（乙醇）的濃度對提取效果影響較大。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 碧根果殼總黃酮提取物的抗氧化能力

2.3.1 DPPH自由基清除能力評價(jià)

DPPH法穩(wěn)定性和靈敏度較好，其乙醇溶液呈紫色，遇到抗氧化物質(zhì)時(shí)，能使其溶液顏色逐漸消失，即可根據(jù)DPPH的褪色程度來間接評價(jià)待測物的抗氧化活性[15]。從圖5可以看出，在碧根果殼總黃酮提取液質(zhì)量濃度20～100 μg/mL范圍內(nèi)，清除DPPH自由基的能力隨提取液質(zhì)量濃度的增加而增加，在所有質(zhì)量濃度下，提取物的DPPH自由基清除能力均大于維生素C對照組。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，清除率最高，達(dá)到91.5%。說明碧根果殼總黃酮有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

圖5 碧根果殼提取物對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力評價(jià)

研究表明，黃酮類化合物對超氧陰離子自由基有很好的清除作用[16]。由圖6可知，碧根果殼提取物清除超氧陰離子自由基的能力隨質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL 時(shí)，清除率最高，達(dá)到80.9%。雖然比維生素C的清除率低，但是也能說明碧根果殼總黃酮有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的能力。

圖6 碧根果殼提取物對超氧陰離子自由基的清除能力

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助乙醇溶液浸提法提取碧根果殼中的總黃酮，由單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化篩選出最佳的工藝條件為：乙醇濃度65 %，料液比1∶30，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間50 min。此條件下總黃酮提取率達(dá)到1.932%。以DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力為評價(jià)指標(biāo)，表明碧根果殼總黃酮提取物具有較高的抗氧化活性，其抗氧化能力隨提取物質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。因此，碧根果殼可以作為黃酮提取資源加以開發(fā)和利用。本研究探索了碧根果殼中總黃酮的提取條件和抗氧化活性，為進(jìn)一步推進(jìn)堅(jiān)果殼的綜合利用及產(chǎn)品開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

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Optimization of extraction and antioxidant activity of total flavonoids in pecan shell

KANG Kun1, WANG Jun-bin1, 2,Corresponding Author, WANG Hai-feng3, WANG Feng-tang1,WANG Yao-guo1, WANG Hao1

（1. College of Basic Sciences, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Chemistry Experiment Teaching Center, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 3. Center for Agricultural Analysis and Measurement, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this study, the pecan shell was used as the material to extract total flavonoids by ultrasonic-assisted extraction.Taking the extraction rate of total flavonoids as the evaluation index, on the basis of single-factor test results, the orthogonal extraction method was used to optimize the extraction process conditions, and the scavenging ability of total flavonoids from the pecan shell to 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）and superoxide anion free radical was estimated.Theresults showed that the extraction rate of the total flavonoids reached the highest under the conditions of ethanol concentration of 65%, material-liquid ratio of 1∶30, extraction temperature of 40 ℃ and extraction time of 50 minutes.Within a certain concentration range, the greater the concentration of the flavonoids extract of pecan shell is, the higher its antioxidant capacity will be.

pecan shell; total flavonoids; orthogonal design; antioxidant activity

1008-5394（2020）03-0074-05

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.017

TS 202.3

A

2020-04-13

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810061243）；天津農(nóng)學(xué)院教育教學(xué)研究與改革項(xiàng)目（2018-B-05）

康坤（1997-），女，本科在讀，主要從事生物活性物質(zhì)提取和功能方面的研究。E-mail：2310909343@qq.com。

王俊斌（1979-），男，副研究員，博士，主要從事生物活性物質(zhì)提取和功能方面的研究。E-mail：419647768@qq.com。

責(zé)任編輯：宗淑萍