余海軍，黃鑫，張鈺瑩，周晶晶，田召志，陳佳林，王茜

探索DNA條形碼對哈搖蚊類群部分屬物種鑒定的有效性

余海軍，黃鑫，張鈺瑩，周晶晶，田召志，陳佳林，王茜通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水生生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

采集中國部分地區(qū)哈搖蚊類群，并對其進(jìn)行了DNA條形碼的鑒別研究。研究結(jié)果顯示：種間平均遺傳距離大約是種內(nèi)平均遺傳距離的2.8倍，種內(nèi)與種間存在明顯的“DNA barcoding gap”?；贏utomatic Barcode Gap Discovery（ABGD）法分析遺傳距離與其分布頻數(shù)的關(guān)系；鄰接樹（Neighbor joining tree，NJ tree）分析結(jié)果指出，87.5%的物種能區(qū)分開，并與形態(tài)學(xué)鑒定一致。本研究為探索DNA條形碼在哈搖蚊類群中鑒別的有效性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為填補(bǔ)中國搖蚊昆蟲的DNA條形碼數(shù)據(jù)提供豐富的材料。

哈搖蚊類群；DNA條形碼；物種鑒定；遺傳距離

搖蚊因大部分幼蟲體色為紅色而常被漁民們稱為“紅蟲”，其隸屬于雙翅目（Diptera）長角亞目（Nematocera），其同時(shí)也是水生態(tài)系統(tǒng)中豐富度極高的無脊椎動物類群[1]，能生存于各種類型的水體[2]。由于不同的搖蚊類群對不同水域環(huán)境有一定的適應(yīng)性和敏感性，因此可以不同搖蚊物種的分布為指標(biāo)，監(jiān)測水體水質(zhì)變化[3]。

哈搖蚊群歸屬于搖蚊亞科，其類群包括哈搖蚊屬（）、枝角搖蚊屬（）、擬枝角搖蚊屬（）、小搖蚊屬（）、隱搖蚊屬（）、擬隱搖蚊屬（）、彎鋏搖蚊屬（）和羅搖蚊屬（）8個(gè)近緣屬[4]。該類群的形態(tài)鑒別特征以生殖節(jié)上的下附器退化為特征，其中、是上下附器都比較退化，其余6屬的上附器為細(xì)長狀、足靴狀、指狀和葉狀等形狀而未退化。盡管屬間的分類特征明顯，但是各屬之間的物種存在極大的相似性，從而導(dǎo)致形態(tài)學(xué)鑒定難度加大。

2003年加拿大動物學(xué)家Hebert提出了DNA條形碼，即通過使用一段標(biāo)準(zhǔn)的簡短基因序列作為條形碼對物種進(jìn)行鑒別[5]。近年來DNA條形碼已成功用于搖蚊昆蟲的物種鑒定，特別是在物種的區(qū)分上，Lin等人基于DNA條形碼對長跗搖蚊屬（）121個(gè)形態(tài)種進(jìn)行物種分析，結(jié)果表明，DNA條形碼有效區(qū)分了早期形態(tài)學(xué)研究分類中94.6%的長跗搖蚊屬種類[6]。Song等通過DNA條形碼對多足搖蚊屬（）的93個(gè)形態(tài)種進(jìn)行物種鑒別，結(jié)果顯示94.4%的多足搖蚊屬物種能通過DNA條形碼區(qū)分[7]。此外，在新種的發(fā)現(xiàn)上，DNA條形碼也起到重要的驗(yàn)證作用，Song等人基于DNA條形碼對一個(gè)中國新紀(jì)錄屬進(jìn)行了物種鑒別，結(jié)果顯示該屬單獨(dú)聚為一支，與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果相符[8]。Qi等人通過DNA條形碼對一個(gè)在魚塘表面滑行的海洋物種進(jìn)行了物種鑒別，結(jié)果顯示其與二叉搖蚊屬（）聚為一支，驗(yàn)證了其屬于搖蚊的形態(tài)學(xué)鑒定，并將該物種命名為Qi& Lin sp. n，證明了搖蚊不只是生存在淡水環(huán)境中，也可以在海洋環(huán)境中生存[9]。Lin等人通過DNA條形碼對sp. n.進(jìn)行分子分析，結(jié)果顯示其能與其他多足搖蚊屬物種區(qū)分開，與形態(tài)學(xué)鑒定一致[10]。

本研究通過對中國部分地區(qū)的哈搖蚊類群物種中8屬20種（總計(jì)40樣本），選用COI基因作為分子標(biāo)記，進(jìn)行了DNA條形碼研究，研究結(jié)果為國內(nèi)搖蚊昆蟲的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并對國內(nèi)外的同類研究做一個(gè)補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究所選對象為哈搖蚊類群物種中的8屬20種，均來自中國部分地區(qū)野外采集，采集方式為掃網(wǎng)和燈誘，標(biāo)本均保存于75%～85%乙醇中。所有采集的樣本均在解剖鏡下解剖封片，并將頭部和胸部保存于85%乙醇中，用于后續(xù)分子研究，所有證據(jù)標(biāo)本均保存于天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)遺傳育種實(shí)驗(yàn)室。研究中的對比序列為30條，均從BOLD（Barcode Of Life Data）數(shù)據(jù)庫上下載。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增、序列對比和分析

1.2.1 DNA提取

本試驗(yàn)采用的是試劑盒（QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit）提取法，將整個(gè)胸部和頭部經(jīng)蛋白酶處理后，按照試劑盒說明書提取樣本DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增使用COI基因通用引物L(fēng)CO1490和HCO2198[11]。反應(yīng)體系為25 μL，包含12.5 μL 2× EsMasterMix（CoWin Biotech Co，Beijing，China），上下游引物各0.625 μL，dd H2O 8.75 μL。PCR通過MasterCycler Gradient進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下，預(yù)變性98 ℃ 10s，94 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)：94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min。最后延伸72 ℃ 5 min，10 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)對比和分析方法

1.3.1 序列對比與序列特征分析

將測序公司返回的測序序列導(dǎo)入SeqMan中進(jìn)行序列編輯，將編輯好的序列導(dǎo)出為FASTA文件保存，然后導(dǎo)入MEGA7.0進(jìn)行比對并轉(zhuǎn)換成氨基酸檢查序列檢查是否存在終止密碼子[12]，并對序列特征及各堿基含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 基于遺傳距離分析

基于DNA條形碼遺傳距離的分析方法有ABGD法。利用ABGD[13]軟件在線分析，將編輯好的FASTA文件在線提交到ABGD網(wǎng)站（http：// wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/），選擇Kimura- 2-parameter（K2P）模型，種內(nèi)差異先驗(yàn)值（Prior intraspecific divergence）為0.001到0.100，相對gap寬度值（relative gap width）為1.0，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值[6]。

1.3.3 基于系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在建樹過程中，將比對好的FASTA文件導(dǎo)入MEGA 7.0中并選用K2P分子進(jìn)化模型，節(jié)點(diǎn)處置信度為1 000，其他設(shè)置均為默認(rèn)值。

單倍型結(jié)構(gòu)分析通過將比對好的NEXUS文件導(dǎo)入PopART軟件選用TCS模型分析[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征結(jié)果

本試驗(yàn)一共獲得40條COI序列。所有序列的長度均為658 bp，各序列特征所示，其中各堿基含量的平均值分別為A＝27.5%，T＝38.0%，C＝18.1%，G＝16.5%，序列存在堿基的偏倚性，C＋G的含量顯著低于A＋T的含量，特別是第三核酸位點(diǎn)A＋T的含量高達(dá)88.4%。通過比對序列得出，C（保守位點(diǎn)）占63.5%，V（變異位點(diǎn)）占36.2%。大部分的變異位點(diǎn)都集中在第三核酸位點(diǎn)，其比例為84.4%。結(jié)果表明，在第三核酸位點(diǎn)上的堿基進(jìn)化速率快。

2.2 遺傳距離結(jié)果

本試驗(yàn)40個(gè)樣本，形態(tài)鑒定為種，種內(nèi)遺傳距離為0～0.154 4，平均值為0.048 4；種間遺傳距離為0.068 8～0.173 3，平均值為0.137 8。

ABGD能使用直方圖來展現(xiàn)種內(nèi)、種間遺傳距離及其分布頻數(shù)的關(guān)系，比較種內(nèi)和種間的遺傳距離，當(dāng)種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離時(shí)，則出現(xiàn)“空白區(qū)”，如圖1所示。

圖1 搖蚊亞科物種遺傳距離頻率直方圖

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果

基于40條DNA條形碼序列，構(gòu)建NJ樹，如圖2所示。

圖2 哈搖蚊類群NJ樹

注：不同顏色或形狀代表不同物種，下同

3 討論

3.1 基于遺傳距離閾值分析

DNA條形碼研究中，種內(nèi)與種間遺傳距離的差異是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，當(dāng)種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離時(shí)，就會形成一個(gè)明顯的空白區(qū)，即“DNA barcoding gap”。本研究中種內(nèi)平均遺傳距離為0.048 4，種間平均遺傳距離為0.137 8，后者大約是前者的2.8倍，形成了“DNA barcoding gap”。

遺傳距離閾值是指物種在能形成“DNA barcoding gap”的前提下，使用物種種間遺傳距離與參比的遺傳距離閾值進(jìn)行對比，當(dāng)種間遺傳距離大于參比的閾值時(shí)，則可以將物種區(qū)分為不同物種。閾值法在DNA條形碼的物種鑒定中起著不可替代的作用，然而隨著DNA條形碼研究不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同物種DNA條形碼的閾值各不相同，沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)閾值[16]。BOLD數(shù)據(jù)庫最初將遺傳距離1%作為生物物種的劃分閾值，由于其閾值寬泛，在一定程度上造成了物種的“鑒別過度”，導(dǎo)致同種異名的出現(xiàn)，為了不使物種混亂，近年來BOLD系統(tǒng)默認(rèn)鑒別閾值為3%[17]。

將本研究的序列結(jié)果導(dǎo)入Speciesdentifier軟件中，設(shè)定閾值為1%～10%，物種條形碼聚類結(jié)果如圖3所示，形態(tài)鑒定的數(shù)量為20種，當(dāng)閾值在7%～8%時(shí)，mOTU數(shù)量最接近形態(tài)鑒定的數(shù)量，我們推測哈搖蚊類群的遺傳距離閾值為8%～9%。關(guān)于搖蚊亞科中其他類群的閾值，Song等區(qū)分多足搖蚊屬的遺傳距離閾值為7%～9%[7]，Lin等人區(qū)分長跗搖蚊屬的遺傳距離閾值為4%～5%[6]。綜上所述，本研究分析的哈搖蚊類群遺傳距離閾值，與其同亞科的類群遺傳距離閾值相比，沒有較大差異，在一定程度上證明了DNA條形碼能有效地對哈搖蚊群部分屬物種進(jìn)行鑒定。

圖3 基于閾值的物種聚類分析

3.2 基于系統(tǒng)發(fā)育樹分析

系統(tǒng)發(fā)育樹能直觀地反映物種之間的親緣關(guān)系，本研究中采用的是NJ法，其基于遺傳距離和最小進(jìn)化原理，通過自舉檢驗(yàn)法進(jìn)行聚類，并通過統(tǒng)計(jì)給定樹分支的可信度，得出最優(yōu)樹[18]。在NJ樹中，87.5%的物種能區(qū)分開，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。本研究顯示在哈搖蚊屬中（圖4），雙葉哈搖蚊（）與參考序列分成了3支，但因不能查詢參考序列的證據(jù)標(biāo)本，所以無法對該數(shù)據(jù)做出明確的定論；此外，在哈搖蚊屬中，TN01短葉哈搖蚊（）與參考序列GBMIN55160-17長距哈搖蚊（）聚為一支，且置信度為100%，據(jù)閆春財(cái)博士論文中描述，與在外觀形態(tài)上很相似，即使通過生殖節(jié)的比對也不易區(qū)分，但腋瓣上是否具有緣毛可區(qū)分二者[19]，TN01經(jīng)過形態(tài)鑒定此物種應(yīng)為（圖5），而非?；谝陨贤茢啵瑢ρ芯恐泄u蚊屬所有個(gè)體的DNA條形碼數(shù)據(jù)在PopART軟件中使用TCS模型進(jìn)行單倍型結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖6所示：除與聚為一體外，其他個(gè)體都能單獨(dú)聚為一體，該結(jié)果表明TN01與GBMIN55160-17出現(xiàn)同物異名。由于數(shù)據(jù)庫中GBMIN55160-17參考序列不能提供證據(jù)標(biāo)本與TN01比較，本研究無法做出準(zhǔn)確的定論，在今后的研究中將進(jìn)一步驗(yàn)證。系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果在一定程度上表明，DNA條形碼能有效鑒別搖蚊亞科物種。研究者在進(jìn)行搖蚊亞科昆蟲遺傳距離界定時(shí)，需要比對正確而無疑的DNA條形碼數(shù)據(jù)，在今后的工作中，項(xiàng)目組將與條形碼的同行做更深入地交流，為中國搖蚊亞科DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的完善提供參考。

圖4 哈搖蚊屬物種NJ樹

圖5 TN01樣本的證據(jù)標(biāo)本（翅部分）

圖6 哈搖蚊屬基于TCS haplotype network的分析

4 結(jié)論

本研究通過采集中國部分地區(qū)的哈搖蚊類群昆蟲8屬20種（共計(jì)40樣本），進(jìn)行了DNA條形碼數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用ABDG法分析該數(shù)據(jù)集種內(nèi)、種間遺傳距離及其分布頻數(shù)的關(guān)系，基于NJ樹結(jié)果得出數(shù)據(jù)集分離出20個(gè)物種，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定一致，證明DNA條形碼能準(zhǔn)確鑒別哈搖蚊類群昆蟲，同時(shí)為填補(bǔ)中國搖蚊昆蟲的DNA條形碼數(shù)據(jù)提供豐富的材料。

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Exploring the utility of DNA barcoding in species identification ofcomplex

YU Hai-jun, HUANG Xin, ZHANG Yu-ying, ZHOU Jing-jing, TIAN Zhao-zhi, CHEN Jia-lin, WANG QianCorresponding Author

（Key Laboratory of Aquatic-Ecology and Aquaculture of Tianjin, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

This study collected Harischia complex species in regions of China, using DNA barcoding for species identification. The results showed: the mean interspecific genetic distance was 2.8 times larger than the mean intraspecific genetic distance, with existing distinct “DNA barcoding gap”. Based on Automatic Barcode Gap Discovery genetic distance was analyzed, and it was related with distributed frequency. The results of Neighbor joining tree analysis pointed that 87.5%of the species were distinguished, and it kept conformed to morphological identification. Our results produced basal data for exploring the utility of DNA barcoding in species identification ofcomplex, and provided abundant material for filling up the Chinese DNA barcodes database of Chironomidae.

complex; DNA barcoding; species identification; genetic distance

1008-5394（2020）03-0057-05

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.013

S931.1

A

2019-06-26

國家自然科學(xué)基金（31672264，31672324）

余海軍（1994-），男，碩士在讀，主要從事分子系統(tǒng)學(xué)研究。E-mail：yhj18322040463@163.com。

王茜（1971-），女，副教授，博士，主要從事水生動物及昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)的研究。E-mail：wqgt1999@163.com。

責(zé)任編輯：張愛婷