杜漢宇，葛成菲，汪麗麗，胡燁

枯草芽孢桿菌的分離鑒定及其特性研究

杜漢宇，葛成菲，汪麗麗，胡燁通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

枯草芽孢桿菌是一類好氧、產(chǎn)芽孢、無致病性、無莢膜、能運動的革蘭陽性桿狀菌，由于其優(yōu)越的益生特性，常作為生態(tài)制劑直接添加到飼料中。從天津周邊豬場采集到樣品，分離得到供試菌編號為Y33245。通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列測定等方法，對其進(jìn)行菌株鑒定，并通過藥敏試驗、耐鹽試驗、耐膽鹽試驗、耐人工胃液試驗、耐人工腸液等方法進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性。試驗結(jié)果表明：該菌株為枯草芽孢桿菌，對多種抗菌藥物表現(xiàn)高度敏感，在人工胃液條件下，存活率可達(dá)61.3%；在人工腸液條件下，存活率可達(dá)72.6%，具有極強的抗逆性，通過對其生物學(xué)特性研究表明，該菌具有良好的生物學(xué)特性，可為后續(xù)微生態(tài)制劑研究提供數(shù)據(jù)參考。

枯草芽孢桿菌；16S rDNA；特性；分離與鑒定

枯草芽孢桿菌（）是革蘭陽性桿菌，廣泛存在于自然界中，也可分布在動物體表，不具備致病性[1]。在不適合生長的條件下，可以產(chǎn)生孢子，以一種休眠狀態(tài)存在[2]。在飼料中添加益生菌已經(jīng)變得普遍，其中被我國農(nóng)業(yè)部允許直接喂養(yǎng)的益生菌之一就是枯草芽孢桿菌[3]，常以芽孢的形式加入飼料中[4]，具有調(diào)節(jié)畜禽腸道內(nèi)菌群平衡的功能[5]，可增強動物免疫力，提高生長性能[6]。張媛媛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，一些枯草芽孢桿菌對腸道內(nèi)許多致病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制，在一定程度上抑制其生長，使腸道內(nèi)形成良好的環(huán)境。菌株的純化以及優(yōu)良菌株的篩選已經(jīng)成為一個重要的研究方向。本試驗通過分離純化得到芽孢桿菌，并進(jìn)一步了解菌株相應(yīng)的生物學(xué)特性，為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

天津周邊豬場采集健康豬咽拭子、鼻拭子、糞便。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室提供。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染色試劑盒、抗菌藥物藥敏紙片、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、大豆肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、豬膽鹽、鹽酸、氫氧化鈉、生理鹽水均購自北京路橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、16S DNA通用引物、DNA－Marker、5×Loading Buffer、2×Master Mix、DNA聚合酶等均購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

對采集的樣品進(jìn)行處理，將處理后的樣品用涂布棒均勻涂在大豆瓊脂培養(yǎng)基上，挑取有抑菌環(huán)的單獨菌落接種于大豆肉湯培養(yǎng)基上，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，得到供試菌Y33245，對其進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢、觀察。

1.2.2 生理生化試驗

選取葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、硫化氫等微量生化鑒定管，用接種針將供試菌Y33245分別接種于微量生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄。

1.2.3 藥敏試驗

選取頭孢哌酮、羧芐西林、慶大霉素、丁胺卡那等常用藥物紙片14種，進(jìn)行藥敏試驗，調(diào)整供試菌Y33245濃度至108CFU/mL，取30 μL均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基上放置藥敏紙片，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌環(huán)并記錄結(jié)果。

1.2.4 16S rDNA鑒定

取5 μL純菌液為模板進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP mix 2 μL、r酶0.5 μL、DDH2O 13 μL、C DNA模版 5 μL、引物上游引物1 μL、引物下游引物 1 μL。循環(huán)35次，退火溫度為58℃。將PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA鑒定。

1.2.5 耐鹽能力試驗

配制NaCl濃度為10%、12%、14%、16%的LB培養(yǎng)基，同時設(shè)置對照組，分別接種10 mL供試菌Y33245，置于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。每個梯度取30 μL菌液涂布于大豆瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。每個梯度重復(fù)3次。平板菌落計數(shù)，計算其存活率。

1.2.6 耐膽鹽試驗

將大豆肉湯培養(yǎng)基用豬膽鹽分別配制，膽鹽濃度為0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%。高壓滅菌，備用。分別接種10 mL供試菌，于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。每個梯度重復(fù)3次，平板菌落計數(shù)，計算其存活率。

1.2.7 耐人工胃液試驗

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸16.4 mL，加蒸餾水稀釋，調(diào)節(jié)pH值為2.0，每100 mL溶液中加1 g胃蛋白酶，充分溶解作用，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。將供試菌Y33245進(jìn)行離心，用0.9%生理鹽水洗滌兩次后重新懸浮，分別接種10 mL供試菌Y33245于人工胃液中，震蕩混勻，置于37 ℃搖床中，每隔0.5 h取樣進(jìn)行平板菌落計數(shù)，計算其存活率。

1.2.8 耐人工腸液試驗

取6.8 g KH2PO4，加蒸餾水500 mL溶解，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水至1 000 mL，每100 mL溶液中加1 g胰蛋白酶，充分溶解后用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。將10 mL供試菌Y33245加入到pH值為6.8的人工腸液中，置于37 ℃搖床中，每隔0.5 h取樣進(jìn)行平板菌落計數(shù)，計算其存活率。

1.2.9 體外抑菌試驗

調(diào)整指示菌、試驗菌的濃度至106CFU/mL。取30 μL指示菌涂在大豆瓊脂培養(yǎng)基，取滅菌牛津杯放在培養(yǎng)基中間，牛津杯中加入200 μL菌液，置于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，兩種指示菌每種重復(fù)3次，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離純化及鏡檢結(jié)果

分離得到的供試菌Y33245在大豆瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面粗糙不透明，呈乳白色并帶有一些黃色，有隆起（圖1）。革蘭氏染色呈藍(lán)紫色陽性桿菌，菌體中有透明或淡染芽孢位于菌體中央或稍偏兩側(cè)（圖2）。

圖1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

圖2 細(xì)菌革蘭染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化試驗結(jié)果

菌株的生化反應(yīng)結(jié)果見表1。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[8]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]，初步鑒定供試菌Y33245符合枯草芽孢桿菌的生理生化特性。

表1 Y33245菌種的生化反應(yīng)結(jié)果

注：“＋”表示陽性結(jié)果，“－”表示陰性結(jié)果

2.3 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）藥敏紙片擴散法[10]，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，供試菌Y33245對這14種藥物表現(xiàn)出高敏，說明該菌對于臨床用藥有良好的敏感性，無耐藥性，與賀剛等[11]研究結(jié)果相一致。

表2 Y33245藥敏結(jié)果

注：“S”表示高度敏感

2.4 16S rDNA鑒定結(jié)果

對菌株進(jìn)行PCR擴增后，得到大小為1 500 bp的片段，如圖3，將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示該菌株與枯草芽孢桿菌同源性為99.9%，說明該菌為枯草芽孢桿菌。

圖3 16S rDNA電泳結(jié)果

注：M為Maker，Y33245為菌株Y33245

2.5 耐鹽能力試驗結(jié)果

滲透壓對益生菌的生長有很大影響，滲透壓過高會使益生菌破裂死亡，所以益生菌的耐鹽能力是對其進(jìn)行評價的重要特性之一。試驗結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的逐漸升高，供試菌Y33245生長逐漸受到抑制，存活率有所下降，但當(dāng)NaCl濃度達(dá)到16%時，仍有部分細(xì)菌存活，說明該菌有較強的耐鹽能力[12]，結(jié)果詳見表3。

表3 耐鹽能力試驗結(jié)果

注：“＋＋＋”表示細(xì)菌生長較好；“＋＋”表示細(xì)菌生長良好；“＋”表示細(xì)菌生長一般，下同

2.6 耐膽鹽試驗結(jié)果

益生菌對膽鹽的耐受程度決定其是否可在腸道生長并發(fā)揮功效。耐膽鹽試驗結(jié)果顯示，膽鹽的濃度對供試菌Y33245的生長具有一定抑制作用，本試驗的供試菌Y33245在膽鹽濃度為0.4%的環(huán)境中仍有高于70%的存活率。菌株對膽鹽有很強的耐受力，可以在高濃度膽鹽的環(huán)境中存活。與孫昊巖等[13]的研究結(jié)果一致，詳見表4。

表4 耐膽鹽試驗結(jié)果

2.7 耐人工胃液、腸液試驗結(jié)果

益生菌要發(fā)揮其特定的益生作用，在胃、腸道內(nèi)保持一定的存活率是至關(guān)重要的先決條件。耐人工胃液試驗結(jié)果表明，初期0.5～1.0 h，供試菌Y33245存活率明顯下降，隨著處理時間延長，其存活率下降速度減慢，至3.0 h供試菌Y33245存活率保持在61.0%左右。耐人工腸液試驗結(jié)果表明，供試菌Y33245經(jīng)1.0～2.0 h的腸液處理后，其存活率逐漸下降，3.0 h后存活率維持在72.6%，存活率高于人工胃液。以上結(jié)果表明，供試菌Y33245對胃、腸道環(huán)境具有一定程度的耐受性，詳見圖4。

圖4 耐人工胃液、耐人工腸液試驗結(jié)果

2.8 體外抑菌試驗結(jié)果

本研究以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，進(jìn)行抑菌性分析。結(jié)果表明，供試菌Y33245對大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.5 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為15.0 mm，說明供試菌Y33245對大腸桿菌的抑菌效果較好，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，但也具有一定的抑制病原菌的作用。

3 討論

本研究從健康豬咽拭子中分離提純得到豬源枯草芽孢桿菌一株，對其生物學(xué)特性進(jìn)一步研究，結(jié)果表明，供試菌Y33245在惡劣多變的胃、腸環(huán)境中存活率可達(dá)61%以上，溫燦權(quán)等[14]認(rèn)為對胃、腸道環(huán)境具有很強抗逆性的菌株更容易生長，說明該菌更具有在腸道內(nèi)生長并發(fā)揮優(yōu)良益生特性的潛質(zhì)；另外，供試菌Y33245對常見致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長具有較好的抑制作用，與楊偉平等[15]的研究結(jié)果一致，因此，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌引起的常見疾病，如仔豬腹瀉、斷奶仔豬因黃白痢死亡、斷奶仔豬減重等[16]，可以嘗試添加供試菌Y33245的生態(tài)制劑，探索其抗菌效果，及能否減少或替代抗生素的使用。

竇茂鑫等[17]認(rèn)為從動物體內(nèi)提取出來的益生菌與其寄主動物保持長期的共生狀態(tài)，有著特異性的相互選擇關(guān)系，因此從豬體內(nèi)提取到的菌種更易于在同類動物體內(nèi)定植，更利于作為此類生態(tài)制劑添加到飼料中。供試菌Y33245具有優(yōu)良的飼料學(xué)特性，可以考慮應(yīng)用于動物飼料添加劑中，后續(xù)可以對其益生作用機理等方面做進(jìn)一步研究，探討其在動物轉(zhuǎn)化率、動物免疫力等方面的性能。本研究通過優(yōu)勢菌株篩選等試驗掌握供試菌Y33245的生物學(xué)特性及其體外抑菌活性，為微生態(tài)飼料添加劑的開發(fā)提供候選菌株。

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Isolation, identification, and characterization of

DU Han-yu, GE Cheng-fei, WANG Li-li, HU YeCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

is a kind of aerobic, spore-producing, non-pathogenic, non-capsular and motile Gram-positive bacilli. Due to its excellent probiotic characteristics, it is often added to feed as probiotics. Samples were collected from pigs of pig farms around Tianjin. After a process of isolation, the experimental bacteria numbered as Y33245 was studied by morphology, physiological and biochemical characteristics and identified by 16S rDNA sequence analysis. Also further experiments studied its characteristics by doing drug sensitive test, salt and cholate resistance test, artificial gastric and intestinal fluid（put the strain into the fluid）test. The final experimental results showed that this was astrain which was highly sensitive to a variety of antimicrobial agents. Its survival rate in artificial gastric and intestinal fluid reached up to 61.3% and 72.6% respectively, which showed its strongly resistant characteristic. Meanwhile its biological characteristic has been studied. All these could provide reference data for the follow-up study on microecological agents.

; 16S rDNA; characteristics；isolation and identification

1008-5394（2020）03-0053-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.012

S963

A

2019-5-13

天津市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（201810061182）

杜漢宇（1998-），女，本科在讀，主要從事病源微生物方面的研究。E-mail：3488693226@qq.com。

胡燁（1984-），女，實驗師，碩士，主要從事病源微生物方面的研究。E-mail：66251294@qq.com。

責(zé)任編輯：張愛婷