辛亮亮，舒玥，劉歡，胡雅穩(wěn)，楊琳燕,通信作者

PEG修飾Fe3O4納米粒子（MNPs）的制備及載藥研究

辛亮亮1，舒玥2，劉歡2，胡雅穩(wěn)2，楊琳燕2,通信作者

（1. 天津藥明康德新藥開發(fā)有限公司 國內新藥研發(fā)服務部，天津 300457；2. 天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

鹽酸阿霉素（DOX）是一種抗腫瘤抗生素，通過抑制癌細胞遺傳物質核酸的合成發(fā)揮作用，其抗瘤譜較廣，對于多種腫瘤細胞均有殺滅作用。本研究首先通過共沉淀合成法制備Fe3O4納米粒子（MNPs），再依法制備Fe3O4@SiO2以及Fe3O4@SiO2－NH2納米粒子，然后對Fe3O4@SiO2－NH2樣品進行單端羧基PEG和雙端羧基PEG的修飾，得到Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH樣品，利用PEG修飾產物裝載不同質量的鹽酸阿霉素（DOX），得到Fe3O4@SiO2－NH2－PEG·DOX和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX。熒光分光光度計檢測結果表明，PEG修飾的Fe3O4納米粒子（MNPs）載入不同質量的DOX除增加阿霉素的磁靶向性能外，因PEG的引入，生物相容性也得到增強。

Fe3O4；PEG修飾；DOX；載藥

Fe3O4納米粒子作為典型的磁性功能材料，已被廣泛運用在各個方面，常用作磁記錄材料[1]、顏料[2]、催化劑[3]、磁流體材料[4]、磁性高分子微球、電子材料等，是最常見的磁性納米材料之一，在磁記錄、顏料、磁流體、醫(yī)藥、催化、電子、生物醫(yī)學等領域具有廣闊的應用前景。目前，制備Fe3O4納米粒子的傳統(tǒng)方法是共沉淀法[5]，但因 Fe2＋極易被空氣氧化，為得到純Fe3O4，在制備過程中需要嚴格控制溶液的pH值，同時為了使Fe2＋和Fe3＋按化學計量比反應，需用惰性氣體保護反應體系[6-10]，因此該方法的工藝比較復雜。但與水熱法相比，該方法所制備的納米粒子粒度更小，耗時更短。

鹽酸阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，通過抑制癌細胞遺傳物質核酸的合成來發(fā)揮藥理作用，本品抗瘤譜較廣，對多種腫瘤細胞均有殺滅作用。對乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤及軟組織肉瘤、胃癌、肝癌等均有一定療效，在阿霉素的諸多測定方法中，熒光分析法是測定DOX含量的有效分析方法。

本研究中采用FeCl2、FeCl3和NaOH在氮氣的保護作用下，水浴加熱同時磁力攪拌產生Fe3O4，后用原硅酸四乙酯（TEOS）對其表面進行包覆，得到Fe3O4@SiO2樣品，再用3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）對其表面進行修飾，得到Fe3O4@SiO2－ NH2樣品，后經雙端羧基PEG和單羧基PEG修飾，分別得到Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH和Fe3O4@ SiO2－NH2－PEG MNPs。將所得修飾產物進一步用于阿霉素的裝載，以增強其磁靶向性和生物相容性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

所用試劑：無水乙醇（天津市康科德科技有限公司）；原硅酸四乙酯（TEOS）、3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、鹽酸阿霉素（DOX）（上海源葉生物有限公司）；雙羧基聚乙二醇（CM－PEG－CM，Mw2000）、單羧基聚乙二醇（CM－PEG，Mw5000）（上海金畔生物技術有限公司）。

所用儀器：超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，SB-100D）；水浴恒溫搖床（上海達平儀器有限公司，SKY-110WX）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；磁力攪拌器（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；熒光分光光度計（美國VARIAN公司 Cary Eclipse）。

1.2 Fe3O4的制備

向規(guī)格為100 mL的三頸瓶中加入7.5 mL 0.2 mol/L FeCl3溶液和7.5 mL 0.12 mol/L FeCl2溶液，混合均勻，使整個反應環(huán)境處于氮氣的保護下，加熱至55 ℃，磁力攪拌持續(xù)15 min，迅速加入7.2 mL 3 mol/L NaOH溶液，同時用磁力快速攪拌，反應40 min后，形成的黑色流體再持續(xù)加熱至90 ℃。再經過30 min后，冷卻至室溫，將產物放入50 mL塑料離心管中，置于強力磁鐵上，進行磁鐵吸附使其沉淀，將上清液吸出丟棄，用去離子水多次洗滌沉淀物使其pH呈中性，將上清液再次吸出丟棄，然后放置于真空干燥箱中烘干。

1.3 Fe3O4@SiO2的制備

稱取10份干燥的Fe3O4樣品，每份10 mg，依次放入50 mL塑料離心管中，每管中加入2 mL 0.1 mol/L稀鹽酸，超聲震動20 min使其充分混合后置于磁鐵上，磁鐵吸附沉淀，將上清液吸出丟棄，然后用去離子水洗滌沉淀物。再將20 mL無水乙醇、5 mL去離子水，0.25 mL NH3·H2O依次加入沉淀物中，超聲震蕩20 min，使其充分混合均勻，然后分別向每管中加入32 μL原硅酸四乙酯（TEOS），放入搖床中，轉速140 r/min，室溫震蕩6 h。取出后置于磁鐵上，吸附沉淀，將上清液吸出丟棄，用無水乙醇將沉淀物洗滌，獲得Fe3O4@SiO2。

1.4 Fe3O4@SiO2－NH2的制備

磁鐵吸附沉淀，棄去上述樣品中的無水乙醇溶液，向每管樣品中分別加入4 mL無水乙醇，之后再加入50 μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS），30 min超聲震蕩，使其充分混合均勻，然后放入搖床，轉速設置為140 r/min，室溫震蕩24 h，得到樣品Fe3O4@SiO2－NH2后用磁鐵進行吸附，使其沉淀，將上清液吸出丟棄，隨后用無水乙醇將沉淀物洗滌，進行真空干燥。

1.5 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG的制備

將單羧基聚乙二醇（CM－PEG，0.5 g，0.1 mmoL）溶于2.5 mL 2-嗎啉乙磺酸（MES，0.1moL/L，pH6）中，加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，0.019 2 g，0.1 mmoL）超聲30 min，后加入N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，0.011 5 g，0.1 mmoL）超聲30 min，放在搖床中，轉速為140 r/min，經過12 h讓其活化。使Fe3O4@SiO2－NH2沉浸在上述溶液中，每管20 mg，超聲波震蕩30 min使其充分混合后，放入搖床中，轉速140 r/min，過夜反應。置于磁鐵上，使其吸附沉淀后棄去上清液，使用去離子水洗滌1次，將其置于真空干燥箱中，80 ℃過夜干燥，制得Fe3O4@SiO2－NH2－PEG。

1.6 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的制備

制備過程同1.5所述，僅用雙羧基聚乙二醇（CM－PEG－CM，0.2 g，0.1 mmol）代替CM－PEG（0.5 g，0.1 mmol），制得Fe3O4@SiO2－NH2－ PEG－COOH。

1.7 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG裝載DOX研究

取3份20 mg的Fe3O4@SiO2－NH2－PEG，置于3個10 mL離心管中，分別向離心管中加入10、15、20 mg的DOX，同時在每管中加入8 mL乙醇溶液，超聲15 min使其充分溶解后，放置搖床震蕩，轉速140 r/min。搖床震蕩過夜后，用磁鐵吸附使其沉淀后，吸取上清液，用2 mL無水乙醇洗殘渣后定容至10 mL，再將上清液封口保存，殘渣置于干燥箱干燥，得到DOX裝載產物Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG·DOX。

1.8 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH裝載DOX研究

試驗過程同1.7，用Fe3O4@SiO2－NH2－ PEG－COOH代替Fe3O4@SiO2－NH2－PEG樣品，所得樣品標記為Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX。

1.9 DOX釋放行為的研究

由于腫瘤組織偏酸性，故研究偏酸性條件下所制備磁靶向粒子的釋放行為[11]。配制pH5.6的PBS緩沖溶液置于37 ℃下，將10 mg Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG－COOH·DOX和10 mg Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG·DOX樣品加入8 mL PBS緩沖溶液中，然后置于搖床中，轉速140 r/min，分別經過1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h，每隔一段時間取出3 mL作為檢測樣品，再分別補進3 mL新鮮的PBS緩沖溶液。取至最后一次時去掉上清液但不再加入PBS緩沖溶液，殘渣放入干燥箱干燥。

2 結果與分析

2.1 XPS分析

由表1結合N1s譜可知，399.255eV（－N）和400.247eV（－H2）峰的出現(xiàn)，表明APTMS修飾成功。表1結合C1s譜，288.481 eV峰出現(xiàn)（OO/O－NH），原子含量為4.35%，意味著單羧基聚乙二醇修飾成功。表1結合C1s譜，287.722 eV峰出現(xiàn)（OO/O－NH），原子含量為9.35%，意味雙羧基聚乙二醇修飾成功。表1結合N1s譜，401.384 eV峰出現(xiàn)（CO－H），原子百分含量為85.3%，意味著單羧基聚乙二醇修飾成功。表1結合N1s譜，401.108 eV峰出現(xiàn)（CO－H），原子百分含量為55%，同樣意味著雙羧基聚乙二醇修飾是成功的。因此，F(xiàn)e3O4@SiO2－NH2、Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH納米粒子的N1s譜說明APTMS和PEG修飾是成功的[12-15]。

表1 修飾前后材料的結合能和元素比例

圖1 XPS掃描全譜：Fe3O4@SiO2－NH2，F(xiàn)e3O4@SiO2－NH2－PEG，F(xiàn)e3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH

圖2 Fe3O4@SiO2－NH2的C1s譜

圖3 Fe3O4@SiO2－NH2的N1s譜

圖4 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG的C1s譜

圖5 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG的N1s譜

圖6 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的C1s譜

圖7 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的N1s譜

2.2 TGA研究

對Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH樣品進行熱重分析，結果見圖8。由圖8可見，樣品190 ℃開始失重，900 ℃尚未降解完全，從殘留曲線可知，F(xiàn)e3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH樣品穩(wěn)定性優(yōu)于Fe3O4@SiO2－NH2－PEG樣品。

圖8 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的TGA圖

2.3 DOX載藥量研究

利用熒光分光光度計，激發(fā)波長λex＝478 nm，發(fā)射波長592 nm，狹縫寬10 nm，進行熒光測定。結果見圖9，圖10[16,11]。

圖9 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG與載入不同質量DOX產生熒光強度的數(shù)據(jù)曲線圖

圖10 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH與載入不同質量DOX產生熒光強度的數(shù)據(jù)曲線圖

在納米粒子濃度影響的研究中，根據(jù)圖9、圖10表明，載入DOX的質量在10～20 mg時均有峰值，樣品載入DOX后均產生熒光，整體來看，在樣品含量為20 mg時，峰值較好，但熒光強度未呈比例增強，因此后續(xù)試驗以此濃度為標準，未再增加DOX濃度。

2.4 DOX釋放行為的研究

利用熒光分光光度計，激發(fā)波長λex＝478 nm，發(fā)射波長592 nm，狹縫寬10 nm，進行DOX的熒光測定，結果見圖11和圖12。

圖11 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG·DOX釋放不同時間后產生熒光強度的折線圖

圖12 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX釋放不同時間后產生熒光強度的折線圖

根據(jù)已有文獻報道，作為抗癌藥的DOX應在癌細胞生長的偏酸性環(huán)境釋放良好[16]。用pH5.6緩沖液模擬體內偏酸性環(huán)境，F(xiàn)e3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH樣品裝載DOX后釋放曲線較為平緩。見圖12。除去PEG的影響，羧基與DOX中的氨基應存在吸附作用，這可能導致了Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX樣品的平緩釋放。

3 結論

通過試驗表明，氨基化的Fe3O4@SiO2－NH2樣品能夠進行PEG修飾，所得產物Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH經XPS表征，說明單羧基聚乙二醇和雙羧基聚乙二醇均可進行氨基化樣品修飾。熱重分析表明，F(xiàn)e3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH樣品穩(wěn)定性優(yōu)于Fe3O4@SiO2－NH2－PEG樣品。Fe3O4@SiO2－NH2－ PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH樣品在乙醇中能夠裝載DOX。DOX在pH5.6緩沖液中的釋放表明，雙羧基PEG修飾產物裝載DOX樣品Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX釋放曲線較為平緩，釋放效果較好，這可能與MNPs表面的羧基和DOX的氨基之間存在吸附作用有關。

[1] Terris B D，Thomson T. Nanofabricated and self-assembled magnetic structures as data storage media[J]. Journal of Physics D：Applied Physics，2005，38（12）：199-222.

[2] Meng J H，Yang G Q，Yan L M，et al. Synthesis and characterization of magnetic nanometer pigment Fe3O4[J]. Dyes and Pigments，2005，66：109-113.

[3] Zhu Y H，Stubbs L P，Ho F，et al. Magnetic nanocomposites：A new perspective in catalysis[J]. Chem Cat Chem，2010，2（4）：365-374.

[4] González-Alfaro Y，Aranda P，F(xiàn)ernandes F M，et al. Multifunctional porous materials through ferrofluids[J]. Adv Mater，2011，23（44）：5224-5228.

[5] 宋麗賢，盧忠遠，劉德春，等. 分解沉淀法制備磁性納米Fe3O4的研究及表征[J]. 化工進展，2006，25（1）：54-57.

[6] 張鑫，李鑫鋼，姜斌. 四氧化三鐵納米粒子合成及表 征[J]. 化學工業(yè)與工程，2006，23（1）：45-48.

[7] Xu J，Yang H B，Wu Y F，et al. Preparation and magnetic properties of magnetite nanoparticles by sol-gel method[J]. Journal of Magnetism and Magnetic Materials，2007，309（2）：307-311.

[8] Asuha S，Zhao S，Wu H Y，et al. One step synthesis of maghemite nanoparticles by direct thermal decomposition of Fe-urea complex and their properties[J]. Journal of Alloys and Compounds，2009，472（1/2）：23-25.

[9] Fan R，Chen X H，Gui Z，et al. A new simple hydrothermal preparation of nanocrystalline magnetite Fe3O4[J]. Materials Research Bulletin，2001，36（3/4）：497-502.

[10] Zhou Z H，Wang J，Chan H S，et al. Synthesis of Fe3O4nanoparticles from emulsion[J]. J Mater Chem，2001，11（6）：1704-1709.

[11] Chen H，Wang Z，Zong S，et al. SERS-fluorescence monitored drug release of a redox-responsive nanocarrier based on graphene oxide in tumor cells[J]. ACS Appl Mater Interfaces，2014，6（20）：17526-17533.

[12] Zhao S，Wu H Y，Song L，et al. Preparation of γ-Fe2O3nanopowders by direct thermal decomposition of Fe-urea complex：reaction mechanism and magnetic properties[J]. J Mater Sci，2009，44：926-930.

[13] 黃菁菁，徐祖順，易昌鳳. 化學共沉淀法制備納米四氧化三鐵粒子[J]. 湖北大學學報（自然科學版），2007，29（1）：50-52.

[14] Cheng F Y，Su C H，Yang Y S，et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe3O4nanoparticles and their biomedical applications[J]. Biomaterials，2005，26（730）：729-738.

[15] Ghasem R B，Zari H. A novel biocompatible magnetic iron oxide nanoparticles/hydrogel based on poly（acrylic acid）grafted onto starch for controlled drug release[J]. J Polym Res，2013，20（11）：298.

[16] Sun C Y，Qin C，Wang C G，et al. Chiral nanoporous metal-organic frameworks with high porosity as materials for drug delivery[J]. Adv Mater，2011，23（47）：5629-5632.

Preparation and drug loading of PEG modified Fe3O4nanoparticles

XIN Liang-liang1, SHU Yue2, LIU Huan1, HU Ya-wen2, YANG Lin-yan2,Corresponding Author

（1. Domestic Discovery Service Unit, Wuxi App Tec Co., Ltd., Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Doxorubicin hydrochloride（DOX）is an anti-tumor antibiotic that acts by inhibiting the synthesis of nucleic acid in cancer cells. DOX has a broad anti-tumor spectrum and has a killing effect on a variety of tumor cells. In this paper, Fe3O4nanoparticles（MNPs）were prepared by co-precipitation synthesis method, while Fe3O4@SiO2and Fe3O4@SiO2－NH2nanoparticles were prepared by optimizing experimental conditions. And then single and double carboxyl PEG were applied to modify Fe3O4@SiO2－NH2samples. Fe3O4@SiO2－NH2－PEG and Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH samples could be obtained. PEG modified products were loaded with different quality of DOX. Fe3O4@SiO2－NH2－PEG·DOX and Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX samples could be obtained. After detection by a fluorescence spectrophotometer, a conclusion was drawn. The results showed that PEG－modified Fe3O4nanoparticles（MNPs）loaded with different masses of DOX could increase the magnetic targeting properties of DOX, at the same time, biocompatibility could also be enhanced via the introduction of PEG.

Fe3O4; PEG modification; DOX; drug-loading

1008-5394（2020）03-0043-06

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.010

O656.22

A

2019-07-03

天津農學院杰出科研業(yè)績獎勵資助項目（無編號）；國家自然科學基金（31572492，31372482）；省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室資助課題（CMEMR2016-B12）

辛亮亮（1982-），男，副研究員，碩士，主要從事藥物合成研究。E-mail：xll_xll@126.com。

楊琳燕（1982-），女，講師，博士，主要從事納米藥物載體研究。E-mail：y_linyan@163.com。

責任編輯：宗淑萍